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癌基因pim-3的克隆及其对肝癌细胞凋亡的影响

作　者: 邓欢
导　师: 张吉翔
学　校: 南昌大学
专　业: 内科学
关键词: pim-3基因 克隆 凋亡
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 59次
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内容摘要


目的克隆大鼠原癌基因pim-3并构建真核表达重组质粒pEGFP-N2/pim-3,观察它在真核细胞:SMMC-7721中的表达情况以及对细胞凋亡的影响。方法利用Trizol从液氮保存的大鼠骨骼肌组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获取pim-3 cDNA,并构建重组质粒pEGFP-N2/pim-3,转化用CaCl2法制备的大肠杆菌JM-109菌株,酶切以及测序鉴定.将重组质粒通过脂质体介导转染肝癌SMMC-7721细胞后利用倒置荧光显微镜观察基因表达情况,并利用流式细胞术及MTT比色试验对转染细胞的生物学行为进行检测。结果将RT-PCR产物全部用于低熔点琼脂糖凝胶电泳、回收,在DL 2000 Marker 1000bp附近可见清晰条带,与实验设计符合;阳性克隆质粒的酶切电泳和测序结果表明,大鼠pim-3 cDNA的克隆和重组质粒pEGFP-N2/pim-3的构建成功;重组质粒pEGFP-N2/pim-3转染组凋亡细胞占3.5%,质粒pEGFP-N2转染组凋亡细胞占10.7%,而仅加入转染液的空白组凋亡细胞占11.0%,重组质粒转染组与两对照组之间差异有统计学意义（P<0.05）;倒置荧光显微镜可以观察到pim-3在SMMC-7721细胞中的正常表达;MTT比色试验显示原癌基因pim-3能够明显抑制细胞凋亡。结论真核表达重组质粒pEGFP-N2/pim-3构建成功;原癌基因pim-3能明显抑制肝癌细胞凋亡。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
第一章 引言  7-8
第二章 材料与方法  8-21
  2.1 实验材料  8-10
    2.1.1 细胞株、质粒和大鼠来源  8
    2.1.2 主要试剂和产地  8-9
    2.1.3 仪器设备和产地  9-10
  2.2 实验方法和步骤  10-21
    2.2.1 RT-PCR 获得目的基因pim-3 cDNA 片段  10-12
      2.2.1.1 从♂ Wistar 大鼠骨骼肌和心肌组织中提取RNA  10
      2.2.1.2 逆转录即cDNA 的合成  10-11
      2.2.1.3 PCR 扩增  11
      2.2.1.4 纯化回收cDNA  11-12
    2.2.2 重组质粒pEGFP-N_2/pim-3 的构建与鉴定  12-16
      2.2.2.1 LB 液体培养基的配制  12
      2.2.2.2 LB 固体培养基的制备  12
      2.2.2.3 感受态细菌的制备  12-13
      2.2.2.4 质粒pEGFP-N_2的提取  13-14
      2.2.2.5 cDNA 和质粒的双酶切及纯化回收  14-15
      2.2.2.6 酶切产物的连接和转化  15-16
      2.2.2.7 阳性克隆的挑取与鉴定  16
    2.2.3 重组质粒pEGFP-N_2/pim-3 转染真核细胞  16-20
      2.2.3.1 细胞培养常用器具及试剂的消毒  16
      2.2.3.2 细胞培养常用液体的配制  16-17
      2.2.3.3 SMMC-7721 细胞的常规培养  17-19
      2.2.3.4 瞬时转染  19
      2.2.3.5 利用荧光倒置显微镜观察转染细胞  19-20
      2.2.3.6 利用流式细胞仪检测细胞凋亡率  20
      2.2.3.7 MTT 法（即四唑盐比色法）分析  20
    2.2.4 统计学处理  20-21
第三章 结果  21-29
  3.1 从♂ Wistar 大鼠骨骼肌和心肌组织中提取的RNA  21
  3.2 大鼠原癌基因pim-3 的扩增  21-22
  3.3 重组筛选及酶切鉴定结果  22-24
    3.3.1 LB 固体培养基菌落生长情况及阳性克隆的酶切鉴定  22-24
    3.3.2 目的基因片段的测序结果  24
  3.4 pim-3 在真核细胞内的表达情况  24-26
  3.5 流式细胞术检查结果  26-27
  3.6 质粒转染后MTT 比色试验检测结果  27-29
第四章 讨论  29-31
第五章 结论  31-32
致谢  32-33
参考文献  33-36
攻读学位期间的研究成果  36

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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