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菰基因组可转化人工染色体文库的构建及筛选

作　者: 宋成丽
导　师: 江绍玫
学　校: 江西师范大学
专　业: 应用化学
关键词: 菰 基因文库 可转化人工染色体 抗病基因同源序列
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


菰[Zizania lattfolia (Griseb.)](n=17)为须根性多年生沼泽植物,广泛分布于亚洲东部的池塘、沼泽中。它具有水稻栽培品种所需要的多种优良性状:如不感稻瘟病、纹枯病和白叶枯病;茎秆粗壮、分蘖力强,耐低温和深水,灌浆成熟快;籽粒品质好,生物产量高等。TAC载体是结合PAC载体和BIBAC载体的特点构建的人工染色体。与YAC、BAC或PAC载体相比,它不会出现重组交换而导致基因嵌合现象,可以在大肠杆菌和农杆菌中进行穿梭;在农杆菌介导下能直接将外援基因整合到植物基因组中,一旦获得阳性克隆后,不需要亚克隆工作就可以直接转化植物,进行功能互补试验。验证功能后含有目的基因的克隆,即使基因结构未知,也可直接进行植物转基因育种工作,加速分子育种的研究进程。对菰的遗传与育种研究尚处于初步阶段,因此为了加快菰基因组的研究,本研究在参考了前人文库构建方法的基础上,建立了一套可转化基因文库构建技术体系。包括高分子量DNA的提取、酶切条件的确定、片段大小的选择、目的大片段的回收、连接及转化体系。最终获得了所需大小的插入片段,重组率高的TAC文库构建体系。利用所建立的TAC技术体系,采用可转化植物的pYLTAC17载体,选择菰幼芽组织,提取高分子量DNA,选择合适的酶量,选取50~200 kb范围的片段,构建了菰基因组TAC文库。该TAC文库由91,584个重组子组成,以12个克隆为一个克隆池的方式保存于81块96孔板中。随机挑取30个克隆采用碱裂解法提取质粒,琼脂糖凝胶电泳表明平均插入片段约45 kb,库容量相当于菰基因组大小的5倍。对文库进行了叶绿体、线粒体DNA污染率统计,表明叶绿体、线粒体DNA污染率较低。对文库进行了稳定性测试,表明菰TAC克隆可以稳定地保存在大肠杆菌中。NBS-LRR(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat),即核苷酸结合位点和富亮氨酸重复的胞内受体蛋白。它是植物抗病基因中最多的一类,抗病性是它们目前被发现的唯一功能。本研究在构建菰基因组TAC文库的基础上,以一条NBS-LRR类抗病基因同源序列FZ14(DQ239432)为模板设计特异引物对,以菰基因组DNA为模板优化PCR体系及条件,通过克隆池PCR法筛选菰基因组TAC库,初步得到2个抗病基因阳性克隆,为菰抗性基因的图位克隆和功能验证提供基础。菰基因组文库的构建可以促进菰基因的图位克隆的进程,为菰其他基因工程的研究提供了技术平台,将在菰基因组研究和利用基因工程方法对水稻进行遗传改良中得到进一步的应用。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-4
缩写词  4-7
第一章 研究背景  7-19
  1.1 菰及其在水稻中的应用  7-8
  1.2 基因组文库  8-9
  1.3 人工染色体  9-14
    1.3.1 酵母人工染色体（YAC）  10
    1.3.2 细菌人工染色体（BAC）  10-11
    1.3.3 源于P1 的人工染色体（PAC）  11
    1.3.4 双元细菌人工染色体（BIBAC）  11-12
    1.3.5 可转化人工染色体（TAC）  12-14
  1.4 植物抗病基因的研究进展  14-19
    1.4.1 植物抗病反应  14
    1.4.2 植物抗病基因  14-15
    1.4.3 NBS-LRR 类抗病基因类似序列  15-17
    1.4.4 植物抗病基因的克隆  17-19
第二章 菰基因组TAC 文库的构建及筛选  19-44
  2.1 材料  19-21
    2.1.1 主要材料  19-20
    2.1.2 主要试剂  20-21
    2.1.3 主要仪器  21
  2.2 方法  21-28
    2.2.1 菰HMW DNA 的制备  22-23
    2.2.2 TAC 克隆载体的制备  23-24
    2.2.3 感受态细胞的制备  24
    2.2.4 连接转化  24-25
    2.2.5 收集与保存  25
    2.2.6 菰基因组TAC 文库的鉴定  25-26
    2.2.7 菰基因组TAC 文库的筛选  26-28
  2.3 结果与分析  28-39
    2.3.1 菰HMW DNA 的制备  28
    2.3.2 预酶切条件的确定  28-29
    2.3.3 大量酶切后分离基因组DNA  29
    2.3.4 连接转化  29-30
    2.3.5 菰基因组TAC 文库克隆保存  30
    2.3.6 菰基因组TAC 文库的鉴定  30-35
    2.3.7 菰基因组TAC 文库的筛选  35-39
  2.4 讨论  39-43
    2.4.1 构建TAC 文库的优势  39
    2.4.2 构建菰基因组TAC 文库条件的优化  39-40
    2.4.3 菰基因组TAC 文库的鉴定  40-41
    2.4.4 菰基因组 TAC 文库的保存和筛选  41
    2.4.5 菰基因组TAC 文库的应用  41-43
  2.5 结论  43-44
参考文献  44-48
致谢  48-50

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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