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枯草芽孢杆菌B11菌株拮抗物质的生物合成基因的克隆及鉴定

作　者: 吴雪
导　师: 冯家勋
学　校: 广西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 枯草芽孢杆菌 基因文库 拮抗 聚酮合酶 基因簇
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 31次
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内容摘要


枯草芽孢杆菌菌株B11对广泛的植物病原真菌和细菌都具有拮抗作用。本工作以柯斯质粒pWEB：：TNC为载体构建了枯草芽孢杆菌菌株B11的基因文库，文库含9000个克隆。文库克隆中插入DNA片段平均大小为42.1kb，该文库含有菌株B11基因组中任一基因的概率为99.99％。采用平板活性检测法筛选文库，筛选到一个对茄青枯假单胞菌菌株P13具有拮抗活性的文库克隆6XN9527，该克隆的重组质粒pGXN9527含有50kb的菌株B11的DNA。文库克隆对革兰氏阴性植物病原细菌水稻黄单胞菌水稻变种也具有拮抗活性，而对革兰氏阳性细菌地衣芽孢杆菌和植物病原真菌尖孢镰刀菌西瓜专化型、立枯丝核菌、水稻稻灰梨孢菌则没有拮抗活性。对pGXN9527进一步亚克隆得到13个重组克隆，测定重组克隆的核苷酸顺序并进行序列拼接，得到一个连续的28.481 kb DNA序列。序列分析表明pGXN9527的28.481 kb DNA序列含有一个聚酮合酶基因簇pksA～pdhG，该基因簇与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)FZB42的pks2基因簇中的pks2D～pdhA有96％～99％的同源性。pksA具有一个2028bp的ORF(开放阅读框)，可编码含675个氨基酸的蛋白质，所编码产物与解淀粉芽孢杆菌FZB42的Pks2D(GenBank索引号CAG23966.1)的氨基酸序列有96％的一致性和97％的相似性；pksB具有一个6999bp的ORF，可编码含2332个氨基酸的蛋白质，所编码产物与解淀粉芽孢杆菌FZB42的Pks2E(GenBank索引号CAG23967.1)的氨基酸序列有96％的一致性和98％的相似性；pksC具有一个5721bp的ORF，可编码含1906个氨基酸的蛋白质，所编码产物与解淀粉芽孢杆菌FZB42的Pks2F(GenBank索引号CAG23968.1)的氨基酸序列有97％的一致性和98％的相似性；pksD具有一个7386bp的ORF，可编码含2441个氨基酸的蛋白质，所编码产物与解淀粉芽孢杆菌FZB42的Pks26(GenBank索引号CAG23969.1)的氨基酸序列有97％的一致性和98％的相似性；pksE具有一个3855bp的ORF，可编码含1284个氨基酸的蛋白质，所编码产物与解淀粉芽孢杆菌FZB42的Pks2H(GenBank索引号CAG23970.2)的氨基酸序列有96％的一致性和97％的相似性；pksF具有一个1128bp的ORF，可编码含375个氨基酸的蛋白质，所编码产物与解淀粉芽孢杆菌FZB42的Pks21(GenBank索引号CAJ57404.1)的氨基酸序列有97％的一致性和98％的相似性；pdhG具有一个871bp的ORF，可编码含290个氨基酸的蛋白质，所编码产物与解淀粉芽孢杆菌FZB42的PdhA(GenBank索引号CAJ57405.1)的氨基酸序列有98％的一致性和99％的相似性。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-8
目录  8-10
第一章 前言  10-20
  1.1 芽孢杆菌与植物病害生物防治  10-11
  1.2 枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质及其生物合成基因  11-15
    1.2.1 枯草芽孢杆菌及其产生的抗菌物质  11-13
    1.2.2 枯草芽孢杆菌抗生素的生物合成基因  13-15
  1.3 抗生素生物合成基因的克隆方法  15-18
    1.3.1 基因组文库筛选法  15-17
    1.3.2 常用的基因文库筛选方法  17-18
    1.3.3 其它的抗生素生物合成基因克隆方法  18
  1.4 本工作的基础和目的  18-20
第二章 材料与方法  20-43
  2.1 材料  20-26
    2.1.1 菌株与质粒  20-22
    2.1.2 菌种保存  22-23
    2.1.3 培养基、培养条件和抗生素  23-25
    2.1.4 常规溶液、缓冲液、酶及试剂  25-26
    2.1.5 实验仪器  26
  2.2 方法  26-43
    2.2.1 总 DNA的提取  26-28
    2.2.2 质粒的提取  28-30
    2.2.3 质粒 DNA的纯化、定量与沉淀  30-31
    2.2.4 DNA的酶切、电泳及 DNA片段浓度测算  31-32
    2.2.5 总 DNA的部分消化  32-33
    2.2.6 DNA片段的回收  33-34
    2.2.7 载体的脱磷酸化  34-35
    2.2.8 DNA连接  35
    2.2.9 质粒 DNA以及 DNA连接产物的转化  35-38
    2.2.10 PCR反应  38
    2.2.11 Cosmid文库的构建和筛选  38-41
    2.2.12 拮抗物质基因的鉴定  41-42
    2.2.13 拮抗物质的提取  42
    2.2.14 拮抗活性检测  42-43
第三章 结果与分析  43-63
  3.1 基因文库的构建  43-45
    3.1.1 枯草芽孢杆菌菌株 B11总 DNA的提取  44-45
    3.1.2 菌株 B11文库的构建  45
  3.2 文库的筛选  45-47
  3.3 克隆 GXN9527的抗菌谱分析  47-48
  3.4 拮抗物质生物合成基因的克隆与鉴定  48-63
    3.4.1 pGXN9527的一级亚克隆及分析  48-50
    3.4.2 pGXN9527的二级亚克隆及分析  50-53
    3.4.3序列拼接  53-55
    3.4.4 填补缺口和 PCR验证  55-57
    3.4.5 与拮抗物质生物合成相关的基因序列分析  57-63
第四章 结论与讨论  63-66
参考文献  66-77
致谢  77-78
附录:参与的科研、取得的成果和发表的文章  78

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治
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