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陆地棉NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析

作　者: 赵磊
导　师: 简桂良
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 陆地棉棉花黄萎病抗病基因同源序列 NBS
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

棉花黄萎病是一种毁灭性的病害,对棉花生产造成重大影响。陆地棉是我国主要栽培的棉花品种,但对黄萎病的抗性一直不理想。现代分子生物学技术应用于棉花抗黄萎病的研究,对促进棉花抗病育种具有重要作用。植物抗病基因克隆对抗病育种和抗病机制的研究具有重要意义。根据植物抗病基因具有的高度的保守区域的序列设计引物扩增抗病基因同源片段(RGA)的候选基因法,克隆棉花中的RGA序列,作为分子标记整合到植物分子连锁图谱中,或将其作为探针筛选基因组文库,获得候选抗病基因不失为一条克隆抗病基因的捷径。本文首先对9个陆地棉品种进行了黄萎病抗性鉴定。以一个感病品种为对照,连续3年对9个陆地棉品种田间病圃的黄萎病抗病性进行鉴定,结果表明,3个为高抗品种,2个为抗病品种,2个为耐病品种,2个为感病品种。3个高抗品种对黄萎病抗性非常高,发病率小于20%,抗黄萎病效果已经比较理想;两个感病品系表现出对黄萎病高度感病,发病率均在80%以上。且各品种三年间的相对病指无显著差异,抗病性稳定。应用同源序列克隆法,根据已知抗病基因的NBS保守区P-loop和GLPL设计一对简并引物,以上述9个陆地棉品种DNA为模板,扩增出片段大小为500 bp左右的目的条带,经回收、连接pGM-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过蓝白斑筛选、菌落PCR以及质粒酶切验证获得350个阳性克隆。经测序分析,最终在8个棉花品种中得到74条具有完整开放读码框的棉花RGAs。与已知抗病基因的NBS区比对,结果表明,这74条RGAs均包含NBS保守结构域所具有的P-loop(Kinase-1a)、Kinase-2、Kinase-3a 3个模体和GLPL区,以及Meyers定义的RNBS-A、B、C3个模体。氨基酸聚类分析表明,每个品种中的RGAs均包含TIR-NBS类RGAs和nonTIR-NBS类RGAs两类,TIR类RGAs具有RNBS-A-TIR结构特点,nonTIR类RGAs具有RNBS-A-nonTIR结构特点。与双子叶植物中同时存在TIR与nonTIR两类NBS-LRR的研究结果相一致。同源性分析表明,这74条RGAs与已知的抗病基因相似性较高。TIR类RGAs与已知TIR-NBS类抗病基因L6、M、Gro1-4、N的相似性在32%～50%;nonTIR类RGAs与已知nonTIR-NBS类抗病基因I2C-1、Mi-1.1、RPM1、RPP8、RPS2、RPS5、XA1、PRf的相似性在23.2%～56.5%。在nonTIR类部分RGAs比对中发现抗病品种和感病品种存在两个位点的氨基酸突变,抗病品种这两个位点为异亮氨酸(I),感病品种为苏氨酸(T)。这两个位点的突变很有可能与黄萎病抗、感病性状相关联。对8个棉花品种的TIR和nonTIR两类RGAs分别进行分子方差分析,其品种内变异均远大于品种间。中性检验(Tajima’s test)结果表明,两类RGAs的D值均未达到显著水平,符合中性假说。这些陆地棉抗病基因同源序列RGAs的获得及分析,可为定位、克隆棉花抗病基因及利用分子标记辅助选择育种提供研究基础,并对了解棉花NBS-LRR类R基因的起源和进化有一定参考价值。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-12
第一章引言  12-29
  1.1 棉花及棉花黄萎病  12-16
    1.1.1 棉花生产概况  12
    1.1.2 棉花的主要病害  12-13
    1.1.3 棉花黄萎病  13-16
      1.1.3.1 棉花黄萎病的分布与为害  13-15
      1.1.3.2 棉花黄萎病的致病机制  15
      1.1.3.3 棉花黄萎病的病原菌  15-16
  1.2 植物抗病反应及抗病基因的研究  16-28
    1.2.1 植物抗病反应  16
    1.2.2 抗病基因的结构和功能  16-22
      1.2.2.1 已克隆的植物抗病基因及其结构  16-17
      1.2.2.2 已克隆的抗病基因分类  17-20
      1.2.2.3 NBS  20
      1.2.2.4 LRR  20-21
      1.2.2.5 TIR 与CC  21
      1.2.2.6 STK  21-22
    1.2.3 抗病基因的起源和进化  22-24
      1.2.3.1 植物抗病基因的起源  22
      1.2.3.2 抗病基因的存在形式  22
      1.2.3.3 抗病基因的演化  22-24
    1.2.4 抗病基因克隆和分离  24-26
      1.2.4.1 图位克隆法（positional cloning）  24
      1.2.4.2 转座子标签法（transposon tagging）  24-25
      1.2.4.3 发展中的植物基因克隆新技术  25
      1.2.4.4 抗病基因同源序列法（Resistance gene analogs，RGAs）  25-26
    1.2.5 RGA 法的研究进展  26-28
      1.2.5.1 RGAs 的应用  26-27
      1.2.5.2 利用RGA 法分离植物抗病基因同源序列的相关研究  27
      1.2.5.3 RGA 法的优越性与局限性  27-28
  1.3 立题意义与实验设计  28-29
    1.3.1 立题意义  28
    1.3.2 实验设计  28-29
第二章不同棉花品种的抗病性鉴定  29-37
  2.1 材料与方法  29-30
    2.1.1 实验材料和对照设置  29
    2.1.2 实验方法  29-30
      2.1.2.1 病情调查  29
      2.1.2.2 统计分析  29-30
      2.1.2.3 鉴定结果校正  30
      2.1.2.4 抗性分级  30
  2.2 结果与分析  30-36
    2.2.1 棉花黄萎病抗性鉴定  30-35
    2.2.2 不同棉花品种黄萎病抗性的统计分析  35-36
  2.3 讨论  36-37
第三章棉花抗病基因同源序列的克隆与分析  37-66
  3.1 材料与试剂  37-39
    3.1.1 植物材料  37
    3.1.2 菌种及质粒  37
    3.1.3 生化试剂  37-39
  3.2 方法  39-44
    3.2.1 棉花总DNA 的提取  39
    3.2.2 棉花总DNA 质量检测  39
    3.2.3 PCR 引物的设计与合成  39-40
    3.2.4 PCR 扩增  40
    3.2.5 PCR 扩增产物回收  40-41
    3.2.6 回收产物的连接  41
    3.2.7 感受态细胞的制备  41-42
    3.2.8 连接产物的转化  42
    3.2.9 阳性克隆的菌落PCR 鉴定  42-43
    3.2.10 质粒的提取（碱裂解法）  43
    3.2.11 质粒的酶切验证  43
    3.2.12 DNA 测序及序列分析  43-44
  3.3 结果与分析  44-64
    3.3.1 棉花RGA 的克隆  44-47
      3.3.1.1 棉花总 DNA 的提取  44-45
      3.3.1.2 PCR 扩增  45
      3.3.1.3 目的片段回收  45-46
      3.3.1.4 连接转化与蓝白斑筛选  46
      3.3.1.5 菌落PCR 与酶切验证  46-47
    3.3.2 棉花RGA 的序列分析  47-64
      3.3.2.1 阳性克隆的测序结果初步分析  47-48
      3.3.2.2 棉花抗病基因同源序列的聚类分析与相似性比较  48-59
      3.3.2.3 RGAs 多态性研究  59-64
  3.4 讨论  64-66
第四章全文结论  66-68
  4.1 不同棉花品种的抗病性鉴定  66
  4.2 棉花抗病基因同源序列的克隆与分析  66-68
参考文献  68-76
附录：74 个 RGAS 测序结果  76-93
致谢  93-94
作者简历  94

陆地棉NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析

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