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基于TAC多基因转化载体的构建及其转化水稻的研究

作　者: 林美坤
导　师: 王锋
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻多基因可转化人工染色体遗传转化
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本研究把植物可转化人工染色体(TAC)载体技术应用于水稻四种转运蛋白基因蔗糖转运蛋白基因(ossut5z)、细胞壁转化酶基因(oscin3)、单糖转运蛋白基因(osmst4)和ATP/ADP转运蛋白基因(oaat)的多基因载体构建和遗传转化。载体构建是通过以pYLTAC为骨架载体,将OsSUT5Z、OsMST4、OsCIN3和OAAT等4个控制同化产物运输相关的基因构建在同一个表达载体上,分别构建了载体pTAC747H-CIN3-MST4、pTAC747H-OAAT-SUT5和pTAC747H-OAAT-SUT5- CIN3-MST4,总插入片段大小为30kb左右。以实验室原有的转化体系为基础,初步探索通过根农杆菌介导转化大片段多基因载体的转化效率的影响因素,包括不同水稻基因型、不同植物培养基、不同的农杆菌感染愈伤组织的方式等因素,从而有效的提高大片段转化效率。通过根农杆菌介导转化将三个表达载体转入明恢86和日本晴成熟胚诱导的愈伤组织中,其中转明恢86的转化率分别为12.5%、11.3%和8.4%;转日本晴的转化率分别为11.7%、9.8%和8.7%。并获得了8、5和4个克隆的转基因水稻植株,分子检测表明这些克隆中外源基因已整合入水稻基因组。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-9
第1章绪论  9-30
  1.1 综述  9-27
    1.1.1 大片段DNA 插入文库(Large size insertgenomic library)发展史  9-14
      1.1.1.1 质粒文库  10
      1.1.1.2 λ噬菌体(λ-bacteriophage)文库  10
      1.1.1.3 粘粒(Cosmids)文库  10-11
      1.1.1.4 酵母人工染色体(YAC)文库  11
      1.1.1.5 细菌人工染色体(BAC)文库  11-12
      1.1.1.6 P1 克隆系统和源于P1 的人工染色体(PAC)文库  12
      1.1.1.7 双元细菌人工染色体(BIBAC)文库  12-13
      1.1.1.8 可转化人工染色体(TAC)文库  13-14
    1.1.2 转化人工染色体(TAC)文库的发展  14-18
    1.1.3 TAC 文库的筛选方法  18-19
    1.1.4 TAC 多基因转化载体系统中的特异性重组系统的概述  19-23
    1.1.5 水稻遗传转化技术  23-25
      1.1.5.1 农杆菌介导遗传转化  23-24
      1.1.5.2 影响农杆菌介导水稻遗传转化效率的因素  24-25
    1.1.6 ossut5、oscin3、osmst6和oaat/haat的研究现状  25-27
  1.2 本论文立题目的和意义、研究内容、技术路线  27-30
    1.2.1 立题目的和意义  27-29
    1.2.2 研究内容  29
    1.2.3 技术路线  29-30
第2章转运蛋白基因组TAC 载体的构建、鉴定和转化  30-52
  2.1 材料与方法  30-36
    2.1.1 实验材料  30-33
      2.1.1.1 供试水稻品种  30
      2.1.1.2 菌株和质粒  30-33
      2.1.1.3 主要试剂和仪器  33
    2.1.2 实验方法  33-36
      2.1.2.1 载体构建的一些基本方法  33-36
  2.2 载体构建  36-50
    2.2.1 多基因组TAC747 载体的构建原理  36-37
    2.2.2 中间载体回收  37
    2.2.3 OsMST4 与OsCIN3 双基因TAC 载体构建  37-41
    2.2.4 OsSUT5Z 与OAAT 双基因TAC 载体构建  41-46
    2.2. 5 OsSUT5、OsMST4、OsCIN3和OAAT等4个基因构建成的TAC 多基因载体  46-50
  2.3 载体电击转化农杆菌的PCR 检测  50-51
  2.4 结论  51-52
第3章转基因植株的遗传转化和分子检测  52-65
  3.1 材料与方法  52-57
    3.1.1 实验材料  52
      3.1.1.1 供试水稻品种  52
      3.1.1.2 菌株  52
    3.1.2 实验方法  52-57
      3.1.2.1 转基因植株的遗传转化  52-53
      3.1.2.2 影响农杆菌介导大片段基因水稻遗传转化效率的因素研究  53-54
      3.1.2.3 PCR 模板的制备及引物  54-57
  3.2 结果与分析  57-64
    3.2.1 影响农杆菌介导水稻遗传转化效率的因素  57-62
      3.2.1.1 水稻基因型对水稻大片段载体转化的影响  57
      3.2.1.2 抗氧化剂对水稻愈伤组织转化率的影响  57-58
      3.2.1.3 菌液浓度对转化效率的影响  58
      3.2.1.4 愈伤组织继代次数对水稻大片段载体转化的影响  58-59
      3.2.1.5 转化载体大小对转化效率的影响  59-60
      3.2.1.6 转基因植株的获得  60-62
    3.2.2 转基因水稻植株的分子检测  62-64
      3.2.2.1 标记基因（hpt）的检测  62-63
      3.2.2.2 转基因植株的目的基的PCR 的检测  63-64
  3.3 结论  64-65
讨论  65-68
附录  68-73
参考文献  73-81
致谢  81

基于TAC多基因转化载体的构建及其转化水稻的研究

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