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基因在家蚕脂肪体细胞核抽提物中的体外剪接

作　者: 朱虹
导　师: 夏庆友
学　校: 西南大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 性别决定细胞核抽提基因克隆体外剪接
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

在高等真核生物中，前体mRNA的剪接及其调节是一个复杂的、由多因子参与的过程，它对基因的正常功能的发挥起着重要的作用。pre-mRNA剪接，即把内含子去除并把外显子序列连接成为成熟的mRNA，是基因表达与调控的重要环节之一。选择性剪接是一个存在于多细胞生物中的普遍现象，人类基因中约有30％的基因有选择性剪接发生。多细胞生物的功能、行为和有机体本身的复杂性是通过蛋白多样性的增加或有效地协调各组分之间的网络关系完成进化历程。家蚕是重要的经济昆虫，更是经典遗传学研究的模式生物之一。许多研究证明雄蚕比雌蚕抗性好，体质强，叶丝转化率高。单养雄蚕可在不增加成本的前提下提高15％的产丝量，而且雄蚕丝纤度细、偏差小，丝质好，利于缫制高档生丝。因此，研究家蚕的性别决定机制，最终实现单养雄蚕可以有效地提高蚕业生产效率和经济效益。同时鳞翅目昆虫是主要的农林害虫，而家蚕是鳞翅目昆虫的典型代表，解明家蚕的性别决定机制，以家蚕的性别决定机制为模式，有助于开展农林害虫防治的研究。在家蚕的性别调控机制中，基因的选择性剪接发挥了重要作用。因Bmdsx基因在雌蚕和雄蚕中的拼接方式不同而产生性别分化。实验证明，像果蝇的dsx基因在雌雄中有不同的加工方式一样，Bmdsx在雌蚕中是默认的拼接方式，而在雄蚕中是阻碍性拼接，有一个上游阻碍物阻碍了第三和第四外显子的拼接，使雄蚕中缺少了第三和第四外显子。为了研究Bmdsx上游阻碍物对Bmdsx拼接的影响，我们建立体外剪接实验体系来进行验证。为此，我们先利用RAB4B基因建立一个体外剪接的体系，然后研究mini Bmdsx基因在家蚕雄性脂肪体细胞核抽提物中的体外剪接。RAB4B基因是一个与细胞凋亡有关的基因，大小为1439bp，外显子为1094bp，内含子为345bp。由于Bmdsx基因内含子较大，很难在体外发生拼接反应，因此需要构建一个小的Bmdsx基因，我们称之为mini Bmdsx基因。即将大部分内含子序列去掉，只剩下含有拼接必需成分的较小内含子。构建好的mini Bmdsx基因大小为2264bp，含有4个外显子，3个内含子。将克隆到pGEM-T Easy载体上的mini Bmdsx基因经PCR扩增纯化后，体外转录得到的pre-mRNA，在细胞核抽提物中进行体外剪接。构建的mmi Bmdsx基因在雄蚕核抽提物中发生剪接时，第三外显子和第四外显子连同内含子一同被剪接掉，第二和第五外显子连在一起，大小为362bp。在家蚕的性别调控机制中，Bmdsx扮演一个比较重要的角色。Bmdsx通过在雌雄中的选择性拼接最终决定个体的雌雄分化，本研究建立了一个mini Bmdsx基因的体外剪接体系，这将有助于通过体外拼接实验来研究Bmdsx的拼接机制，并进一步找到Bmdsx上游的调控因子，进而研究家蚕性别决定的分子机制。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章文献综述  11-27
  1.1 生物体性别决定类型  11-14
    1.1.1 性染色体决定性别  11-12
    1.1.2 环境条件决定性别  12
    1.1.3 染色体的单双倍数决定性别  12
    1.1.4 性染色体与常染色体的比例决定性别  12
    1.1.5 多基因决定性别  12
    1.1.6 性反转  12-13
    1.1.7 微生物引起的性别扭变  13-14
  1.2 家蚕性别决定研究进展  14-18
    1.2.1 家蚕性别决定分子机制的研究  14-16
    1.2.2 与果蝇性别决定基因同源的家蚕基因  16-18
  1.3 选择性剪接  18-27
    1.3.1 转录  19-21
    1.3.2 选择性剪接  21-24
    1.3.3 体外剪接体系  24-27
第二章引言  27-29
  2.1 研究背景和意义  27
  2.2 研究的技术路线  27-29
第三章家蚕体外剪接基础体系的建立  29-47
  3.1 家蚕脂肪体细胞核蛋白的提取  29-34
    3.1.1 家蚕脂肪体细胞核蛋白抽提方法的建立  29-30
    3.1.2 家蚕脂肪体细胞核蛋白的检测  30-34
  3.2 RAB4B基因的克隆  34-39
    3.2.1 实验材料  34
    3.2.2 载体及宿主菌  34
    3.2.3 试剂  34-35
    3.2.4 其他常用试剂  35
    3.2.5 主要仪器  35
    3.2.6 实验方法  35-39
  3.3 体外转录  39-41
    3.3.1 pre-mRNA底物的制备  39-40
    3.3.2 体外转录体系  40
    3.3.3 转录后RNA的纯化  40-41
  3.4 实验结果与分析  41-43
    3.4.1 家蚕细胞核蛋白抽提  41-42
    3.4.2 家蚕基因组的提取  42
    3.4.3 家蚕RAB4B基因的克隆  42-43
    3.4.4 体外转录  43
  3.5 讨论  43-47
    3.5.1 细胞核蛋白抽提条件的优化  44
    3.5.2 细胞核蛋白提取中的关键因素  44
    3.5.3 体外转录的主要影响因素和技术关键  44-47
第四章家蚕RAB4B基因和mini Bmdsx基因的体外剪接  47-53
  4.1 溶液的配制  47
  4.2 实验方法  47-48
    4.2.1 实验步骤  47
    4.2.2 剪接体系  47-48
    4.2.3 剪接产物的纯化  48
  4.3 RT-PCR  48-49
    4.3.1 反转录  48-49
    4.3.2 反转录PCR  49
  4.4 实验结果和分析  49-52
    4.4.1 剪接过程中RNA的检测  49
    4.4.2 RAB4B基因的RT-PCR  49-50
    4.4.3 mini Bmdsx基因的RT-PCR  50-52
  4.5 讨论  52-53
    4.5.1 RAB4B的体外剪接  52
    4.5.2 mini Bmdsx的体外剪接  52-53
第五章结论  53-55
参考文献  55-59
参加过的研究课题及发表论文目录一览表  59-61
致谢  61-62
附录  62

基因在家蚕脂肪体细胞核抽提物中的体外剪接

内容摘要

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