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蛋白质内含子体内定向进化和切割、分段表达及体外剪接

作　者: 周倩
导　师: 孟清；刘相钦
学　校: 东华大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蛋白质内含子 定向进化 切割 分段表达 体外剪接
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


蛋白质内含子是位于蛋白质前体内的插入序列,其两侧的氨基酸序列称为蛋白质外显子。在蛋白质前体翻译后成熟过程中,蛋白质内含子通过四个连续的亲核置换反应精确地从前体蛋白质中自我切除,同时催化两侧蛋白质外显子以肽键相连产生成熟蛋白,这一过程称为蛋白质剪接。蛋白质内含子自主催化的反应为蛋白质合成和加工提供了新的途径,因而在蛋白质工程及其它领域具有广泛的应用前景。但是,在目前的研究中,仍然存在着大量未解决的问题,如异源生物体内剪接效率低、蛋白质内含子纯化系统效率低以及不能实现蛋白质剪接人为控制等。针对以上问题,本研究对蛋白质内含子进行了如下改造:将卡那霉素抗性和蛋白质剪接活性相结合,成功的在异源生物体内构建了依赖卡那霉素抗性的蛋白质内含子筛选系统。选择TerThyX和Ssp DnaX两个微小蛋白质内含子对该筛选系统的可行性进行检验,结果显示:含有卡那霉素的平板上的菌落生长情况与western blot检测结果一致,证明本筛选系统完全可行。进一步结合定向进化的策略,利用易错PCR,构建菌落数超过10~6的突变库,在抗性平板上获得了4个高剪接活性的突变蛋白质内含子。Westernblot显示:改造后的Ssp DnaX微小蛋白质内含子在E.coli细胞内剪接活性高于90%,真正解决了异源生物体内剪接活性低的问题。利用已获得的高剪接活性的S1和S11型断裂蛋白质内含子Rma DnaB和Ssp GyrB,成功定点突变了N端或C端与剪接直接有关的保守位点的氨基酸,在E.coli体内将其改造为只有一端可发生断裂,不能进行完整的剪接作用的N端和C端切割元件。检测改造后的断裂蛋白质内含子一端切割的效率,筛选具高效切割活性的蛋白质内含子,以用于深入研究蛋白质剪接机制,以及进一步构建高效的蛋白纯化系统。将断裂蛋白内含子的N端和C端一小段多肽共同表达形成一个融合蛋白(NC蛋白),同时在另一系统中表达intein中间片段(IM蛋白),成功构建了Rma DnaB和Ssp GyrB的NC融合蛋白和IM蛋白。分别纯化NC和IM蛋白后,在16℃,25℃,37℃条件下进行体外剪接反应,从而达到辅助断裂蛋白质内含子两端二聚化的目的。通过检测反应结果,解开IN和IC特异性结合之谜。通过本论文的研究,在蛋白质内含子高级结构未知的情况下,筛选获得高剪接活性的蛋白质内含子,完成了对蛋白质内含子功能的进化。并实现了断裂蛋白质内含子的空间隔离,这对多个蛋白质片段的体外连接具有重要的指导作用,并为研究蛋白质内含子剪接过程的可控性奠定理论基础。随着对蛋白质内含子的剪接机制研究的深入,蛋白质内含子的功能将进一步得到开发,从而为蛋白质工程研究开辟新的途径。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
符号说明  10-12
第1章 绪论  12-26
  1.1 引言  12
  1.2 蛋白质内含子的发现  12-13
  1.3 蛋白质内含子的分类  13-15
  1.4 蛋白质内含子的结构特征  15-16
  1.5 蛋白质内含子的剪接机制  16-18
  1.6 蛋白质内含子的应用  18-22
  1.7 目前研究存在的问题  22-23
  1.8 本课题研究的内容、目的及意义  23-26
第2章 实验材料、技术与设计方案  26-40
  2.1 材料和仪器  26-33
  2.2 实验技术  33-37
  2.3 实验流程  37-40
第3章 异源生物体内蛋白质内含子的定向进化  40-52
  3.1 依赖卡那霉素抗性的筛选系统  40-43
  3.2 利用筛选系统检测剪接活性  43-48
  3.3 蛋白质内含子的定向进化  48-52
第4章 高剪接活性蛋白质内含子的体内切割  52-56
  4.1 高剪接活性蛋白质内含子的定点突变  52-54
  4.2 突变克隆的鉴定及获得  54-55
  4.3 蛋白质印迹检测体内切割反应  55-56
第5章 蛋白质内含子分段表达、纯化及体外剪接  56-65
  5.1 蛋白质内含子NC融合蛋白的构建  56-61
  5.2 蛋白质内含子中间IM片段的构建  61-63
  5.3 蛋白片段的诱导、纯化  63-64
  5.4 体外不同温度下的剪接反应  64-65
第6章 结果及分析  65-88
  6.1 异源生物体内蛋白质内含子的定向进化  65-75
  6.2 高剪接活性蛋白质内含子的体内切割  75-79
  6.3 蛋白质内含子分段表达、纯化及体外剪接  79-88
第7章 结论  88-90
  7.1 结论  88-89
  7.2 创新点  89
  7.3 展望  89-90
参考文献  90-94
硕士期间发表论文和参加科研情况说明  94-96
附录  96-98
致谢  98

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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