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体外单链RNA扩增系统的建立及蓝舌病毒靶向溶癌特性研究

作　者: 胡俊
导　师: 董长垣
学　校: 武汉大学
专　业: 病原生物学
关键词: 单链RNA 体外转录蓝舌病毒10型溶癌病毒凋亡
分类号: R73-36
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本研究直接以来自患者血清中的HCV单正链RNA为模板，采用核酸序列依赖的等温扩增技术(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，结合单管RT-PCR技术，建立了体外高效扩增特异性单链RNA(Single strand RNA，ssRNA)系统。扩增产物的片段大小和特异性经凝胶电泳和斑点杂交得以确认；紫外分光光度法定量检测结果显示本系统扩增HCV ssRNA产物量可达1.8μg／μL，扩增效率20倍于RT-巢式PCR方法。建立的体外扩增ssRNA技术具有应用于双链RNA(Double strands RNA，dsRNA)蓝舌病毒(Bluetongue Virus，BTV)靶向性溶癌分子机理研究的潜力。随后在对BTV-10体外感染特性的研究中，我们在相同条件下，将该病毒接种于1株原代人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast cells，HEL)和3株传代细胞株：人肝癌细胞(Human hepatic carcinoma 3B cells，Hep-3B)；人肺腺癌细胞(Human lung carcinoma A549 cells，A549)；鼠正常成纤维细胞(Normal mouse fibroblastscells，NIH 3T3)。感染病毒36小时后光镜、电镜及细胞存活率的MTT统计学分析均显示该病毒对HEL细胞不敏感，对Hep-3B、A549、NIH3T3具有程度不同的选择性杀伤效应；结合MTT统计学分析及流式细胞仪检测结果，可见病毒对Hep-3B、A549肿瘤细胞最为敏感，而且病毒在Hep-3B中杀伤方式倾向于以诱导凋亡为主，在A549中则倾向于以增殖裂解细胞为主；细胞周期中各期细胞DNA含量的比较结果提示BTV-10的感染对人胚肺细胞的增殖周期无影响。综合多项观察指标可见：BTV在体外可特异的杀伤Hep-3B和A549肿瘤细胞株，此种特异性杀伤效应的产生是BTV诱导宿主肿瘤细胞凋亡或／和病毒增殖最终导致宿主细胞裂解死亡这两种力量整合作用的结果，哪种力量会居效应发挥的主导地位将与宿主肿瘤细胞内肿瘤特有基因背景(如RAS信号通道等激活状况)有一定相关性。本研究为BTV所具有的特殊靶向性抗癌生物学特性充实了实验理论依据；亦为深入研究BTV靶向性抗癌分子机理和用基因工程技术发展更理想的重组dsRNA靶向性溶癌病毒，奠定了实验室技术基础。

全文目录

一、中文摘要  4-5
二、英文摘要  5-8
三、引言  8-10
四、正文  10-42
  材料与方法  10-22
  结果  22-31
  讨论  31-38
  结论  38-39
  参考文献  39-42
五、综述  42-54
  正文  42-50
  参考文献  50-54
六、后记  54

体外单链RNA扩增系统的建立及蓝舌病毒靶向溶癌特性研究

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