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水稻线粒体ATP合成酶6kDa亚基基因的功能解析

作　者: 张欣欣
导　师: 柳蔘奎
学　校: 东北林业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 碳酸盐逆境 F1F0-ATP合成酶线粒体ATP合成酶6kDa业基基因(RMtATP6) 蛋白细胞定位遗传转化原核表达
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本研究把碳酸盐（NaHCO₃、Na₂CO₃）对植物造成的逆境称为“碳酸盐逆境”（Carbonate stress）。从水稻根cDNA文库中筛选出一些与碳酸盐逆境相关的基因，水稻线粒体ATP合成酶6kDa亚基基因（简称：RMtATP6基因）为其中之一。该基因编码的氨基酸序列与Jansch等人（1996）从马铃薯（Solanum tuberosum）线粒体中纯化的线粒体ATP合成酶6kDa亚基氨基酸序列（F₁F₀-ATP合成酶的F₀部分）具有同源性，但是这个小蛋白的功能尚不清楚，其基因也没有被同定。在本研究中：这个基因被克隆（accession number：AB055076），在碳酸盐逆境胁迫下它的表达特性被解析。RMtATP6基因编码的蛋白预测分子量为6.578 kDa，预测的细胞内存在位置为线粒体膜间间隙，结果预示了RMtATP6基因编码的蛋白为水稻线粒体ATP合成酶6kDa亚基基因。Southern杂交结果表明RMtATP6基因是水稻核基因组中的一个单拷贝基因。通过对RMtATP6基因在植物中的表达特性及在碳酸盐逆境下在酵母中的功能解析，表明了该基因与碳酸盐逆境有关。将RMtATP6基因与绿色荧光蛋白GFP基因融合，构建到酵母表达载体pYES2中，通过电转化法将pYES2-RMtATP6-GFP质粒转入酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVScl中，并将转化的细胞用荧光染料Mito Tracker Red CmxRos（Molecular Probes）染色，利用激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Biological Microscope，OLYMPUS）观察，从而对RMtATP6基因编码的蛋白在酵母细胞中进行定位。实验结果证明：RMtATP6基因编码的蛋白存在于酵母的线粒体中，这个结论与我们最初预测的RMtATP6基因编码的蛋白在细胞内的存在位置所得到的结果一致。为了更好的研究RMtATP6基因与碳酸盐逆境的关系，将RMtATP6基因克隆到植物表达载体PBI121上，并通过电转化法将质粒PBI121-RMtATP6转入到农杆菌（Agrobacterium fumefaciens）EHA105中，然后通过农杆菌介导法转化烟草。经过生根筛选、PCR检测和Southern杂交检测，证明RMtATP6基因已经整合到烟草的基因组中。将RMtATP6基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-3中，并将pGEX-6p-3-RMtATP6导入到E.coli BL21菌株，经IPTG诱导，得到一个分子量约32 kDa的RMtATP6-GST融合蛋白，并利用GST亲和介质Glutathione-Sepharose 4B对该融合蛋白加以纯化，得到了纯化的RMtATP6-GST融合蛋白。RMtATP6转基因烟草和RMtATP6-GST融合蛋白纯化工作的完成，为进一步研究该基因在碳酸盐逆境下的功能奠定了良好的基础。

全文目录

1 前言  10-15
  1.1 国内外技术现状及发展趋势(文献综述)  10-12
  1.2 本课题的研究背景、目的和意义  12-15
2 水稻线粒体ATP合成酶6kDa亚基基因(RMtATP6)的分离、序列分析及同定  15-20
  2.1 实验材料  15
    2.1.1 植物材料  15
    2.1.2 实验试剂  15
      2.1.2.1 植物基因组DNA提取试剂  15
      2.1.2.2 Southern杂交试剂  15
  2.2 实验方法  15-18
    2.2.1 水稻根表达cDNA文库的建立与筛选  15-16
    2.2.2 DNA序列分析  16
    2.2.3 Southern杂交分析  16-18
      2.2.3.1 CTAB法提取植物基因组DNA  16
      2.2.3.2 植物基因组DNA的限制性酶切及电泳分离  16-17
      2.2.3.3 转膜  17
      2.2.3.4 探针的标记  17
      2.2.3.5 Southern杂交  17
      2.2.3.6 洗膜与信号检测  17-18
  2.3 实验结果与分析  18-20
    2.3.1 RMtATP6基因的分离、序列分析及同定  18-19
    2.3.2 探针标记  19
    2.3.3 RMtATP6基因的Southern杂交分析  19-20
3 RMtATP6基因在碳酸盐逆境下的表达特性及在酵母中的表达及功能解析  20-26
  3.1 实验材料  20
    3.1.1 植物材料  20
    3.1.2 菌株和载体  20
    3.1.3 实验试剂  20
      3.1.3.1 RNA提取试剂  20
      3.1.3.2 主要培养基  20
  3.2 实验方法  20-22
    3.2.1 植物总RNA的提耿(Trizol Reagent一步提取法)  20-21
    3.2.2 酵母表达质粒pYES2-RMtATP6的构建及酵母转化  21
    3.2.3 酵母总RNA的提取  21
    3.2.4 Northern杂交  21-22
    3.2.5 酵母的培养及生长曲线的制作  22
  3.3 实验结果与分析  22-26
    3.3.1 RMtATP6基因在碳酸盐逆境下的表达特性  22
    3.3.2 酵母表达质粒pYES2-RMtATP6的酶切鉴定  22-23
    3.3.3 RMtATP6基因在酵母中的表达及功能分析  23-26
4 RMtATP6基因编码的蛋白在酵母细胞中的定位  26-31
  4.1 实验材料  26
    4.1.1 菌株及载体  26
    4.1.2 实验试剂  26
  4.2 实验方法  26-27
    4.2.1 质粒pYES2-EGFP和pYES2-RMtATP6-EGFP的构建  26
    4.2.2 酵母细胞的培养  26
    4.2.3 酵母活细胞的染色  26-27
    4.2.4 活细胞显微镜观察  27
  4.3 实验结果与分析  27-31
    4.3.1 质粒pYES2-EGFP和pYES2-RMtATP6-EGFP的鉴定  27
    4.3.2 RMtATP6基因编码的蛋白在酵母细胞中的定位  27-31
5 农杆菌介导转化法转化烟草  31-36
  5.1 实验材料  31
    5.1.1 植物材料  31
    5.1.2 菌株及载体  31
    5.1.3 实验试剂  31
  5.2 实验方法  31-33
    5.2.1 PBI121-RMtATP6植物表达载体的构建  31
    5.2.2 农杆菌介导的遗传转化  31-32
      5.2.2.1 菌株的活化及工程菌液的制备  31-32
      5.2.2.2 叶盘法转化烟草  32
    5.2.3 转基因植株的PCR检测  32
    5.2.4 转基因植株的Southern杂交检测  32-33
  5.3 实验结果与分析  33-36
    5.3.1 植物表达质粒PBI121-RMtATP6的酶切签定  33
    5.3.2 烟草转化芽的获得及卡那霉素抗性分析  33-34
    5.3.3 转RMtATP6基因烟草的PCR检测  34-35
    5.3.4 转RMtATP6基因烟草的Southern杂交检测  35-36
6 RMtATP6基因的原核表达及融合蛋白的纯化  36-41
  6.1 实验材料  36
    6.1.1 菌株及质粒  36
    6.1.2 实验试剂  36
  6.2 实验方法  36-38
    6.2.1 RMtATP6-GST融合基因的原核表达载体的构建  36
    6.2.2 RMtATP6-GST融合蛋白的小量诱导表达  36-37
    6.2.3 RMtATP6-GST融合蛋白的大量表达及纯化  37
    6.2.4 Westernblotting分析  37-38
      6.2.4.1 电转移  37
      6.2.4.2 蛋白的免疫检测  37-38
  6.3 实验结果与分析  38-41
    6.3.1 RMtATP6-GST融合基因原核表达载体的酶切鉴定  38
    6.3.2 RMtATP6-GST融合蛋白的表达  38-39
    6.3.3 RMtATP6-GST融合蛋白的纯化  39-40
    6.3.4 Western blotting分析  40-41
7 结论与讨论  41-44
  7.1 水稻线粒体合成酶6kDa亚基基因的同定  41
  7.2 RMtATP6基因的定位  41-42
  7.3 RMtATP6基因与碳酸盐逆境的关系  42-44
参考文献  44-51

水稻线粒体ATP合成酶6kDa亚基基因的功能解析

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