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STG凝集素纯化及体外抗病毒活性研究

作　者: 徐进
导　师: 陈朝银
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: STG 凝集活性分离纯化抗HIV-1ⅢB活性抗HSV-2活性
分类号: R512.91
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

人类免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的艾滋病,已给人类健康带来了极大的危害。高效抗逆转录病毒治疗(highly active anti-retroviral therapy, HAATR)虽有一定的疗效,但不能完全清除病毒、毒副作用大等一系列问题。近年来HSV感染发病率急剧增高,已成为最流行的性传播疾病之一,同样严重威胁着人类健康,并可使患者易感HIV。阿昔洛韦(ACV)治疗HSV感染具有较好的效果,但易产生耐药毒株。目前临床上常用的抗病毒药都存在副作用,还易产生耐药性。天然产物抗病毒具有多靶点作用,不易产生耐药性,且副作用毒性低等优点。因此,在丰富的植物资源中寻找新的抗病毒制剂已成为令人瞩目的新领域。STG种仁捣碎,晒干,石油醚脱脂得到脱脂STG粉。分离实验从STG凝集素能凝集血红细胞的性质出发,以提高凝集素的总活力和比活力为目标。在冷低温(4℃)条件下生理盐水浸泡提取,硫酸铵分级沉淀,透析后通过Sephadex G-25凝胶过滤层析、HITrap Q Sepharose XL离子交换层析纯化可得到STG凝集素纯品。凝集素的分离纯化组分纯度分析通过SDS-PAGE电泳进行验证。SDS-PAGE显示为单一条带,分子量为63.4kDa。STG凝集素具有很强的兔血凝集活性,在浓度为30.4μg/ml时仍能凝集兔红细胞,同时STG凝集素还具有凝集鸡、猪、人血A型、人血B型、人血AB型和人血O型红细胞的作用。葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖对STG凝集素的兔红细胞凝集活性具有不同程度抑制作用。研究了不同温度、pH对STG凝集素兔血凝集活性的影响,结果表明温度在在60℃以下、pH5-8不影响STG凝集素的凝血活性,所以STG凝集素具有很强的温度和pH耐受性。此外,还研究了金属离子对凝集活性的影响、有机溶剂对凝集活性的影响、变性剂对凝集活性的影响。实验结果表明Ca2+、Mg2+对STG凝集素的凝血活性有着重要影响；苯酚、异丙醇能较大程度抑制凝血活性；脲抑制其凝血活性是可逆的,SDS抑制其凝血活性不可复性。本文初步研究STG凝集素抗HIV-1ⅢB和HSV-2的活性。依据体外药物筛选的办法,分别以C8166和Vero为靶细胞,检测其抗HIV及HSV的活性,并对其抗病毒活性机理进行初步研究。STG凝集素抗HIV-1ⅢB的IC50为49.8μg/mL, SI为36。为了解STGA抗HIV作用机理,采用时间过程、融合阻断等实验方法进行作用机制的初步研究。实验结果表明STG凝集素抗HIV机制可能是阻断HIV病毒吸附到宿主细胞上。STG除具有抗HIV-1ⅢB的活性,还具有抑制HSV-2的作用,IC50为26.28μg/mL SI为45。抗HSV机制实验结果表明STG凝集素影响不同HSV-2生活周期而起到抑制HSV-2作用。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-15
第一章绪论  15-27
  1.1 植物凝集素  15-25
    1.1.1 凝集素的定义  15-16
    1.1.2 植物凝集素的研究历史  16
    1.1.3 植物凝集素的分类和分布  16-18
    1.1.4 植物凝集素结构  18-20
    1.1.5 植物凝集素的分离、纯化  20
    1.1.6 植物凝集素应用  20-21
    1.1.7 植物凝集素抗病毒  21-25
  1.2 本课题研究的主要目的和意义  25-27
第二章 STG凝集素的分离纯化  27-45
  2.1 引言  27
  2.2 材料和仪器  27-28
    2.2.1 主要试剂  27-28
    2.2.2 主要仪器及实验用品  28
  2.3 实验方法  28-36
    2.3.1 硫酸铵分级沉淀  28-29
    2.3.2 透析  29-30
    2.3.3 考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量  30-31
    2.3.4 血红细胞凝集实验  31-33
    2.3.5 葡聚糖凝胶G-25层析  33-34
    2.3.6 强阴离子交换层析  34
    2.3.7 STGA的纯度鉴定  34-36
  2.4 结果与分析  36-43
    2.4.1 STG凝集素蛋白浓度及其凝集活力测定结果  36-37
    2.4.2 STG凝集素提取次数的研究结果  37-38
    2.4.3 硫酸铵的分级沉淀浓度范围的确定  38-39
    2.4.4 STGA盐析葡聚糖凝胶G-25层析及凝集活性结果  39-40
    2.4.5 HITrap Q Sepharose XL层析结果  40-41
    2.4.6 STGA的纯度鉴定及分子量结果  41-43
  2.5 本章小结  43-45
第三章 STGA的部分性质研究  45-56
  3.1 引言  45
  3.2 材料与仪器  45-47
    3.2.1 主要试剂  45-46
    3.2.2 试剂配制  46-47
    3.2.3 主要仪器  47
  3.3 实验方法  47-49
    3.3.1 STGA的血凝活力测定  47
    3.3.2 温度对凝集活力的影响  47
    3.3.3 酸碱稳定性实验  47-48
    3.3.4 糖抑制实验  48
    3.3.5 金属离子对STGA凝集活力的影响  48
    3.3.6 有机溶剂对STGA凝集活力的影响  48-49
    3.3.7 变性剂对凝集活性的影响  49
  3.4 结果与分析  49-54
    3.4.1 STGA凝集活力的测定结果  49-50
    3.4.2 STGA热稳定性结果  50
    3.4.3 STGA酸碱稳定性结果  50-51
    3.4.4 STGA糖抑制实验结果  51-52
    3.4.5 金属离子对STGA凝集活力的影响结果  52
    3.4.6 有机溶剂对STGA凝集活力的影响  52-53
    3.4.7 变性剂对STGA凝集活力的影响  53-54
  3.5 本章小结  54-56
第四章 STGA体外抗HIV-1_(ⅢB)和HSV-2实验研究  56-77
  4.1 引言  56
  4.2 材料和仪器  56-57
    4.2.1 主要试剂  56-57
    4.2.2 仪器设备  57
  4.3 实验方法  57-65
    4.3.1 STGA体外抗HIV-1_(ⅢB)研究  57-61
    4.3.2 STGA体外抗HSV-2研究  61-65
    4.3.3 数据处理  65
  4.4 结果与分析  65-76
    4.4.1 STGA体外抗HIV-1_(ⅢB)实验结果  65-70
    4.4.2 STGA体外抗HSV-2实验结果  70-76
  4.5 本章小结  76-77
第五章总结与展望  77-80
  5.1 本研究总结  77-79
  5.2 工作展望  79-80
致谢  80-81
参考文献  81-90
附录A 攻读学位期间发表论文目录  90-91
附录B 透析袋处理方法  91-92
附录C RPMI1640培养基的配制  92-93
附录D 硫酸铵饱和度的常用表  93

STG凝集素纯化及体外抗病毒活性研究

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