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CML28/hRrP46P在AML细胞增殖与凋亡调控中的作用机理研究

作　者: 白雪玲
导　师: 张东华
学　校: 华中科技大学
专　业: 血液内科
关键词: CML28/hRrP46P EXOSME WT1 凋亡 增殖 AML
分类号: R733.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


【目的】1.逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及实时定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR)检测CML28/hRrP46P与WT1 mRNA在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)细胞系K562细胞和AML患者骨髓细胞中的表达及表达相关性;2.应用特异性CML28小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)靶向沉默AML细胞系K562细胞中的CML28/hRrP46P基因并检测其沉默效应;3.检测靶向下调CML28/hRrP46P后,K562细胞的增殖与凋亡改变情况,进而研究其在K562细胞中的生物学功能。【方法】1.采用Trizol一步法从K562细胞及29例初治AML患者的骨髓标本中提取细胞总RNA,使用Fermenats公司的逆转录试剂盒反转录成cDNA,利用Primer5.0软件设计针对CML28/hRrP46P及WT1的特异性引物,通过RT-PCR及RQ-PCR检测K562细胞与29例新诊断AML患者骨髓细胞中的CML28/hRrP46P及WT1的mRNA表达情况,并通过相对定量公式2–ΔΔCт计算出了CML28/hRrP46P及WT1的mRNA的相对表达水平,使用SPSS15.0统计学软件计算出了二者的相关系数。2.采用电转染方法将三对特异性的CML28-siRNA转入到K562细胞中,RT-PCR及RQ-PCR检测电转染前后K562细胞中CML28/hRrP46P及WT1的mRNA表达情况;3.采用Annexin V-PI双染法,通过流式细胞术(Flow CytoMeter,FCM)检测靶向下调CML28/hRrP46P后,K562细胞的凋亡改变情况;4.通过CFSE标记的细胞增殖试验检测靶向下调CML28/hRrP46P后,K562细胞的增殖抑制情况。【结果】1. K562细胞株和初治AML患者骨髓细胞同时高表达CML28/hRrP46P及WT1,且二者的mRNA表达水平呈正相关;2.特异性的CML28-siRNA转染至K562细胞株后可以引起CML28/hRrP46P及WT1的mRNA表达水平下降;3.应用特异性CML28-siRNA靶向沉默K562细胞中的CML28/hRrP46P后,可以引起K562细胞的凋亡增加和增殖受抑。【结论】1. CML28/hRrP46P及WT1不仅在K562细胞株中呈高表达,也高表达于各种急性白血病,尤其高表达于AML中,白血病细胞的增殖能力越旺盛,他们的表达水平越高,这说明他们在细胞的增殖调控中扮演着极其重要的角色;2.特异性的CML28-siRNA可以显著抑制K562细胞株中CML28/hRrP46P的mRNA表达,同时也显著抑制CML28/hRrP46P相关分子WT1的mRNA表达,不仅如此,还可以显著抑制K562细胞的增殖,诱导细胞凋亡率的增加,这充分说明他们确实在细胞的增殖与凋亡调控中发挥着不可或缺的作用;3.通过对29例初治AML患者骨髓细胞的CML28/hRrP46P及WT1的mRNA水平进行检测,我们得出二者呈现明显的正相关性,这说明WT1可能是CML28/hRrP46P在AML患者体内发挥作用的关键相关分子之一;有实验已经证实靶向下调WT1的表达同样可以诱导细胞凋亡和抑制细胞的增殖,与本试验中得到的结果一致,这说明CML28/hRrP46P分子并不仅仅是作为已知的肿瘤相关抗原(Tumor association antigen,TAA)来发挥作用,很可能其在细胞的增殖与凋亡中有着更加重要而复杂的作用,可能WT1是其众多的相关作用分子中的一员;此外,相关试验也证实WT1可以通过募集人的EXOSME的核心组分之一hRrP46P来发挥其主要的调控增殖与分化的作用,而CML28被证实和hRrP46P是同类物,除了在CML28的5’端编码区多出了33个氨基酸的编码序列以外,其余核苷酸序列完全相同[3],也就是说WT1在理论上是完全可能和CML28一起来发挥作用,至于具体的作用机制可见本实验组的后续研究。

全文目录


中文摘要  4-7
英文摘要  7-10
前言  10-14
第一部分 CML28/hRrP46P与WT1在 K562细胞和AML患者骨髓 细胞的表达及相关性研究  14-26
  一.实验材料  14-15
  二.试验方法  15-22
  三.实验结果  22-24
  讨论  24-26
第二部分 siRNA靶向干扰K562细胞系中的CML28/hRrP46P后的 基因沉默效应的研究  26-35
  一. 试验材料  26-28
  二. 试验方法  28-30
  三. 试验结果  30-33
  讨论  33-35
第三部分 siRNA 靶向干扰 CML28/hRrP46P 后对 K562 细胞系的 增殖和凋亡行为的影响  35-42
  一. 实验材料  35-36
  二. 试验方法  36-37
  三. 实验结果  37-40
  讨论  40-42
全文总结  42-43
参考文献  43-50
综述  50-62
  参考文献  56-62
致谢  62

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病 > 急性白血病
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