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猪PANE1基因的克隆，定位，表达谱与SNP分析以及PANE1基因和长非编码RNA基因与部分性状的关联分析

作　者: 邓宏
导　师: 李奎
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 PANE1基因 TncRNA 克隆染色体定位表达谱关联分析
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

器官供体来源不足一直是器官移植所面临的严峻问题,如能寻找到理想的异种器官来代替将是解决问题的有效途径。由于猪的器官在形态、生理生化等多方面与人相似,因此猪是进行异种器官移植的理想选择。但移植的排斥反应和移植物的抗宿主病一直都是亟待解决的事情。过去的研究主要集中在主要组织相容性复合体(maior histocompatibility complex,MHC),尤其是人白细胞抗原(HLA)和鼠H-2抗原。但研究表明,还有一些MHC之外的编码区编码的产物也能够引发免疫应答,即所谓的次要组织相容性抗原(minor histocompatibility antigens,miHAg),它们是在MHC限制下被细胞毒T细胞和辅助T细胞识别。大量研究表明,即使MHC相同,miHAgs不同的个体之间进行异基因移植后亦能产生移植物抗白血病(GVL)。即miHAgs的编码基因可以在MHC完全相合的骨髓移植供、受者之间诱发明显的T细胞反应。PANE1(proliferation associated nuclear element 1)基因编码一个新的次要组织相容性抗原HLA-A*0301。研究表明该基因在休眠期的CD19+细胞和B型慢性淋巴性白血病细胞中高表达,可作为在治疗慢性淋巴性白血病的一个潜在靶点。TncRNA是从本室LongSAGE文库中分离得到的一种长非编码RNA,它在猪胎儿骨骼肌发育过程中是上调表达的,且在通城和长白猪妊娠第90天胎儿骨骼肌差异表达。其他物种上的研究表明该非编码RNA在多种病毒感染以及发育相关表达性文库中差异表达,但其基本的分子结构和生物学功能还不清楚。本研究从候选基因的角度,通过克隆、染色体定位、组织表达谱分析、SNP检测和群体分型以及初步的性状关联分析,为进一步研究该基因的功能打下基础,并为为猪的功能基因组领域积累新的基础资料,为猪的分子标记辅助选择提供新的思路。主要研究结果如下:1.依据人PANE1基因cDNA信息,通过由生物信息学及比较基因组学的策略获得的猪EST重叠群设计的猪特异引物克隆出猪PANE1基因特异片断。2.用猪×仓鼠辐射杂种板将新分离的PANE1基因进行了染色体精细定位,该基因定位在SSC5,与AC02位点连锁(LOD=4.91)。3.采用RT—PCR方法检测了PANE1基因在五指山小型猪的心,肝,脾,肺,肾,肌肉,脂肪7个组织中的表达差异,PANE1基因在各组织中均表达,但在脾脏和淋巴组织表达水平相对较高。4.运用PCR-RFLP方法,检测了PANE1基因1个位点的多态性,分析了不同猪种中的基因频率和基因型频率,以及各等位基因在不同猪品种中的分布差异。5.以本室与通城县畜牧局种畜场合作所建立的实验群体(含长白猪22头、大白猪23头、通城猪58头、长大通23头、大长通21头)为材料,分析了PANE1基因的DNA多态位点与部分生长性状的关联,结果发现:与眼肌宽度和腰荐结合处膘厚存在相关。6.以355头长白猪(含父本17头,母本36头,子代302头)为材料,分析了PANE1基因的DNA多态位点与部分免疫性状的关联,结果发现:与0天的RBC分布宽度,17天的淋巴细胞数,32天的平均HGB量和32天的淋巴细胞绝对值存在关联。7.以355头长白猪(含父本17头,母本36头,子代302头)为材料,分析了TncRNA基因的多态位点与免疫性状的关联分析。结果发现此多态位点与0日龄的平均RBC体积(MCV),32日龄的血小板体积(MPV)和大血小板比率(P_L)等免疫指标存在显著关联(P＜0.05);与32日龄的平均HGB量(MCHC)和血小板分布宽度(PDW)等免疫指标存在极显著关联(P＜0.01)

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
1.文献综述  11-18
  1.1 次要组织相容性抗原研究进展  11-15
    1.1.1 次要组织相容性抗原的组织分布  11-12
    1.1.2 次要组织相容性抗原的识别  12
    1.1.3 次要组织相容性抗原的免疫优势  12-13
    1.1.4 次要组织相容性抗原在GVHD/GVL中的作用  13-14
    1.1.5 次要组织相容性抗原基因座  14
    1.1.6 PANE1基因的研究现状  14-15
  1.2 长非编码RNA  15-18
    1.2.1 参与X染色体随机失活  16
    1.2.2 参与基因组印记调控  16-17
    1.2.3 参与形成RNA/蛋白质复合体  17
    1.2.4 TncRNA的研究进展  17-18
2.本研究的目的与意义  18-19
3.材料和方法  19-30
  3.1 材料与试剂  19-22
    3.1.1 DNA样品和组织样品  19-20
      3.1.1.1 DNA样品  19
      3.1.1.2 组织样品  19
      3.1.1.3 载体与菌株  19-20
    3.1.2 主要药试剂及来源  20-21
    3.1.3 常用试剂的配置  21
    3.1.4 主要仪器设备  21
    3.1.5 主要生物学数据库及生物学软件  21-22
  3.2 试验方法  22-30
    3.2.1 总RNA提取、完整性检测和DNase Ⅰ处理  22-23
      3.2.1.1 总RNA提取采用两种方法  22-23
      3.2.1.2 RNA的完整性检测  23
      3.2.1.3 总RNA的无RNase的DNase-Ⅰ处理及其纯化  23
      3.2.1.4 RNA的反转录  23
    3.2.2 候选基因的克隆  23-26
      3.2.2.1 猪PANE1基因EST-重叠群的构建  23-24
      3.2.2.2 引物的设计  24
      3.2.2.3 PCR扩增条件  24
      3.2.2.4 PCR产物的纯化、克隆和测序  24-26
    3.2.3 PANE1的RH定位  26-27
    3.2.4 PANE1基因组织表达谱研究  27
      3.2.4.1 总RNA的提取及RNA浓度与质量的检测  27
      3.2.4.2 RT-PCR扩增体系  27
    3.2.5 猪PANE1 SNP鉴定、分型和关联分析  27-30
      3.2.5.1 引物设计  27
      3.2.5.2 PCR扩增  27-28
      3.2.5.3 试验猪群与测定性状  28
      3.2.5.4 数据处理和统计分析  28-30
4 结果  30-43
  4.1 PANE1基因的克隆与序列分析  30-35
    4.1.1 总RNA的提取与质量检测结果  30
    4.1.2 RT-PCR扩增的结果  30-32
    4.1.3.PANE1基因的进化分析  32-34
    4.1.4 PANE1基因的表达特征分析  34-35
  4.2 猪PANE1基因染色体的精细定位  35-37
  4.3 猪PANE1基因的组织表达结果  37-38
  4.4 猪PANE1基因多态及性状关联分析  38-43
    4.4.1 SNP检测与分型  38
    4.4.2 PANE1基因在不同猪群中的多态性分析结果  38-39
    4.4.3 PANE1基因与胴体性状的关联分析  39-40
    4.4.4 PANE1基因与免疫性状的关联分析  40
    4.4.5 TncRNA基因在小型猪猪群中多态性分析结果  40-42
    4.4.6 TncRNA基因与免疫性状的关联分析  42-43
5.讨论  43-48
  5.1 关于新基因的克隆与生物信息学分析  43-44
    5.1.1 关于新基因的克隆  43
    5.1.2 关于新基因的生物信息学分析  43-44
  5.2 关于新基因定位  44-45
  5.3 关于基因的组织表达谱  45
  5.4 关于SNPs与性状的关联分析  45-48
    5.4.1 猪PANE1基因多态与性状关联分析  46-47
    5.4.2 猪TncRNA基因多态与免疫性状的关联分析  47-48
6 小结  48-50
  6.1 本研究获得的结果  48
  6.2 本研究的创新点  48-49
  6.3 本研究的不足之处  49
  6.4 下一步值得研究的工作  49-50
参考文献  50-57
致谢  57-58
附录  58-61

猪PANE1基因的克隆，定位，表达谱与SNP分析以及PANE1基因和长非编码RNA基因与部分性状的关联分析

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