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猪Arf家族基因的克隆、定位及组织表达谱分析

作　者: 张蓉蓉
导　师: 杨在清
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 梅山猪 Arf家族基因克隆染色体定位组织表达谱
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

ADP核糖基化因子(Arf),是一类GTP结合蛋白。它涉及多种基础的细胞生物学过程,包括细胞的分泌作用,胞吞,吞噬,胞质分裂,细胞粘附以及肿瘤细胞的侵入等多种作用。本文通过RT-PCR方法克隆了梅山猪Arf家族六个基因的全编码区序列。采用猪辐射杂种细胞学技术(RH)对此家族基因进行了染色体定位。此外,运用实时定量PCR方法我们分析了此家族基因在梅山四月龄猪各个组织的表达情况,研究结果如下:1.扩增得到猪Arf基因家族6个成员的全长编码区及部分非编码区cDNA序列,并对其进行了生物信息学的分析。其中Arf1-3编码区全长为546bp,编码181个氨基酸;Arf4,5编码区为543 bp,编码180个氨基酸;Arf6编码区为528bp,编码175个氨基酸。猪Arf1 CDS核苷酸序列与人,小鼠,大鼠的同源基因的相似性分别为90%,88%和88%,其氨基酸序列与人,小鼠,大鼠相似性均为100%;猪Arf2 CDS核苷酸序列与小鼠,大鼠的同源基因的相似性都为89%,其氨基酸序列与小鼠,大鼠相似性均为99%;猪Arf3 CDS核苷酸序列与人,小鼠,大鼠的同源基因的相似性分别为94%,91%和90%,其氨基酸序列与人,小鼠,大鼠相似性均为99%。猪Arf4 CDS核苷酸序列与人,小鼠,大鼠的同源基因的相似性分别为95%,94%和93%,其氨基酸序列与人,小鼠,大鼠相似性度分别为96%,98%和98%;猪Arf5 CDS核苷酸序列与人,小鼠,大鼠的同源基因的相似性分别为95%,93%和93%,其氨基酸序列与人,小鼠,大鼠相似性度均为100%。猪Arf6 CDS核苷酸序列与人,小鼠,大鼠的同源基因的相似性均为96%,其氨基酸序列与人,小鼠,大鼠相似性度均为100%。2.通过搜索NCBI数据库,以及实验扩增部分内含子,最后拼接获得猪Arf1-6的基因组序列。猪Arf1-3,全基因组都包含五个外显子四个内含子;猪Arf4,5,全基因组包含六个外显子五个内含子,和第一类有较大差别;猪Arf6基因组序列只包含两个外显子,一个内含子,与其他两类差别较大,编码区包含在一个外显子中,无内含子间隔。各类别内基因之间编码区外显子大小完全一致,基因序列结构高度一致,外显子内含子交界处都符合GT/AG规则。3.利用辐射杂种板技术和电子定位技术将Arf1-6分别定位在14q21-q22,12p14,5p12-q11,13q21.1,18q24,1q21-q27,猪-人比较基因组图谱证实这两个基因的定位结果与人相应基因在染色体上的位置相对应。4.运用实时定量RT-PCR方法,我们分析了此家族基因在梅山四月龄猪脂肪组织、骨骼肌、心、胃、肝、肺、脾、肠、脑、肾等各个组织中的表达情况,结果表明Arf1-6 mRNA在被检测的十个组织中广谱表达,在肾和胃组织中表达量较高,而骨骼肌和心脏中表达较低。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略语表  11-13
1 前言  13-20
  1.1 Arf的结构和分类  13-14
  1.2 Arf的研究进展  14-20
    1.2.1 Arf调节蛋白  14-15
    1.2.2 GEFs蛋白  15-16
    1.2.3 GAPs蛋白  16-17
    1.2.4 Arf的生理功能及作用机制  17-20
      1.2.4.1 Arf1调节分泌作用的膜运输  17-18
      1.2.4.2 Arf在肌动蛋白重建中的作用机制  18-20
2 材料与方法  20-31
  2.1 材料  20-24
    2.1.1 实验动物及RNA样品制备  20-21
    2.1.2 DNA样品制备  21
      2.1.2.1 cDNA  21
      2.1.2.2 用于基因片段分离的基因组DNA  21
      2.1.2.3 用于基因染色体定位的DNA  21
    2.1.3 工具酶及主要生化试剂  21-22
    2.1.4 试剂盒  22
    2.1.5 菌株  22
    2.1.6 常用试剂配制  22
    2.1.7 主要仪器  22-23
    2.1.8 主要分子生物学软件和网站  23-24
  2.2 实验方法  24-31
    2.2.1 总RNA的提取、纯化处理及鉴定  24-25
      2.2.1.1 组织总RNA的提取  24
      2.2.1.3 组织总RNA的纯化  24-25
      2.2.1.4 总RNA质量、纯度及含量检测  25
    2.2.2 猪Arf家族基因的分离克隆  25-30
      2.2.2.1 猪Arf家族基因cDNA制备  25-28
      2.2.2.2 PCR扩增产物的纯化  28
      2.2.2.3 扩增产物的鉴定(克隆和测序)  28-29
      2.2.2.4 全长cDNA序列分析  29-30
    2.2.3 利用猪辐射杂种板试剂盒进行染色体定位  30
      2.2.3.1 染色体定位所用引物的设计  30
      2.2.3.2 辐射杂交板定位的方法  30
      2.2.3.3 数据分析  30
    2.2.4 实时定量RT-PCR检测猪Arf家族基因的组织表达  30-31
3 结果与分析  31-40
  3.1 猪Arf家族基因cDNA片段扩增与序列分析  31-36
    3.1.1 猪Arf1-6家族基因全编码区cDNA的克隆  31-32
    3.1.2 猪Arf1-6家族基因序列分析  32-35
    3.1.3 猪Arf1-6家族基因组序列及其组成结构分析  35-36
  3.2 猪Arf1-6家族基因的染色体定位  36-38
  3.3 猪Arf1-6家族基因的组织表达谱  38-40
4 讨论  40-41
5 结论与创新点  41-43
  5.1 结论  41
  5.2 创新点  41-43
参考文献  43-49
研究生在读期间发表论文  49-50
致谢  50-51
附录  51-52

猪Arf家族基因的克隆、定位及组织表达谱分析

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