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刚第弓形虫（Toxoplasma gondii）PCR诊断方法的建立与NTA致弱株安全性及免疫效力研究

作　者: 杨莉莉
导　师: 侯继波；姜平；邵国青
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 弓形虫致弱虫株猪安全性免疫效力 PCR
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

刚第弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫，属于真球虫目肉孢子虫科，能够感染人和多种温血动物及鸟类。免疫功能正常的机体感染后多呈隐性持续感染状态，免疫缺陷者如爱滋病患者和器官移植病人，或先天感染者一旦感染弓形虫会带来致死性危险。猪弓形虫病在很多国家普遍存在，成年猪感染多呈亚临床症状，仔猪易感，常表现临床症状。本病获得性感染比胎盘感染途径更为常见。目前国内尚没有动物弓形虫疫苗。动物弓形虫感染最常用的诊断方法有临床诊断、病原学检查和IHA试验，这些方法在特异性、敏感性和早期诊断方面存在一定的缺陷。本研究建立了刚笫弓形虫PCR诊断方法，并测试了刚第弓形虫NTA致弱株的安全性和免疫效力。为建立一套敏感、特异的弓形虫诊断方法，本试验首先以弓形虫ITS 1序列为种特异性遗传标记，建立了弓形虫感染特异PCR诊断方法。采用有限稀释法稀释速殖子DNA，经PCR扩增，检测该方法的敏感性。用同一引物扩增鸡柔嫩艾美耳球虫原虫和弓形虫，检测PCR方法的特异性。人工感染小鼠和家兔，用组织触片法和PCR方法检测感染动物的组织，并检测10头临床疑似病猪的肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肾脏和肝脏等组织，比较两者的敏感性。结果：该PCR方法最低可以检测1pg弓形虫速殖子DNA(井目当于10个速殖子的DNA)。鸡柔嫩艾美耳球虫原虫未扩增出特异条带，仅弓形虫出现特异条带。组织触片和PCR方法对人工感染小鼠组织DNA的检出率均为87.5％(7／8)；对人工感染家兔的检出率分别为50％(3／6)和66.7％(4／6)。对临床疑似弓形虫病猪检测的阳性率均为20％，两种方法的检查结果基本吻合。本试验结果表明，PCR方法可以作为弓形虫感染动物的诊断与检测技术。在安全性研究中，我们以弓形虫强毒株NT株为对照株，对小鼠、家兔和猪进行了NTA致弱株毒力试验和持续感染试验。方法：(1)毒力试验用NTA株1倍和2倍免疫剂量(免疫剂量为10万)分别肌肉注射2头猪，用200倍免疫剂量静脉注射1头猪，另用NT株1×10~5(LD50为5×10~5)剂量接种2头猪。接种后观察猪的体温反应、精神状态、采食状况、剖检变化和死亡状况。用NTA株1倍、10倍、100倍免疫剂量(免疫剂量为5000)分别接种家兔4只，NT株2个LD50剂量(LD50为5000)皮下接种2只家兔，观察家兔的体温反应、精神状态、采食状况和死亡情况。(2)持续感染试验采用组织触片、脑压片和PCR检测组织混悬液方法，检查NTA株接种动物体内持续感

全文目录

原创性声明  3
学位论文版权使用授权书  3-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
引言  11-12
第一章文献综述  12-27
  1 弓形虫及弓形虫感染概述  12-16
  2 弓形虫诊断方法研究  16-17
  3 弓形虫PCR诊断方法与PCR分子标记选择的研究  17-22
    3.1 弓形虫PCR检测分子标记的选择  17-20
    3.2 弓形虫PCR诊断方法研究  20-22
  4 动物弓形虫疫苗的研究  22-25
    4.1 弓形虫减毒活疫苗  22-24
    4.2 虫体特异组分疫苗  24
    4.3 弓形虫亚单位疫苗  24-25
    4.4 国内弓形虫疫苗的研究进展  25
  5 弓形虫慢性感染成囊研究  25-27
第二章刚第弓形虫PCR诊断方法的建立  27-41
  1 材料与方法  27-31
  2 结果  31-36
    2.1 PCR敏感性试验  31
    2.2 PCR特异性试验  31-33
    2.3 人工感染动物组织触片检查和PCR检测  33-35
    2.4 临床疑似病猪组织触片检查和PCR检测  35-36
  3 讨论  36-39
  4 小结  39-41
第三章刚第弓形虫NTA致弱株安全性试验  41-55
  1 材料与方法  42-45
  2 结果  45-48
    2.1 毒力测定  45-46
    2.2 NTA株接种动物的持续感染测定  46-48
  3 讨论  48-52
    3.1 NTA株对动物的毒力分析  48
    3.2 持续感染试验分析  48-52
  4 结论  52-55
第四章刚第弓形虫NTA致弱株免疫保护效力试验  55-60
  1 材料与方法  55-56
  2 结果  56-57
    2.1 猪攻毒保护试验  56-57
    2.2 家兔攻毒保护试验结果  57
  3 讨论  57-58
  4 结论  58-60
全文总结  60-61
参考文献  61-68
致谢  68

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