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棕色固氮菌突变株DJ194，DJ35和UW3固氮酶组分Ⅰ蛋白的研究

作　者: 王煌平
导　师: 朱锦懋；黄巨富
学　校: 福建师范大学
专　业: 植物学
关键词: 棕色固氮菌突变株钼铁蛋白(ΔnifZ钼铁蛋白,ΔnifE钼铁蛋白及CrFe蛋白和MnFe蛋白) 纯化体外重组结晶
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

本研究以体外拆卸与重组的方法对金属原子簇缺失的固氮酶进行研究为主，再次证实固氮酶突变体金属原子簇体外拆装的可行性，同时，通过体外重组证实了不含FeMoco的蛋白污染的具高纯度的CrFe蛋白与MnFe蛋白新型固氮酶存在的可能性，为新型固氮酶的存在提供新证据。纯化出CrFe蛋白与MnFe蛋白并对其特性进行初步研究，此外，还进行△nifZ Av1制备物晶体生长研究。因而研究不仅具有深广度，也具有创新性。用阴离子交换树脂DEAE-52和Q-Sepharose，以及凝胶过滤S-200或S-300柱层析，从棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)nifZ基因缺失的突变株(DJ194)纯化出纯度大于90％的△nifZ钼铁蛋白(△nifZ Av1)制备物，从nifE基因缺失的突变株(DJ35)中纯化出纯度较高的△nifE钼铁蛋白(△nifE Av1)制备物，以及从在含Cr或含Mn的培养基中固氮生长的nifH基因缺失的突变株(UW3)纯化出CrFe蛋白和MnFe蛋白。并对高纯度的△nifZ Av1制备物进行了晶体生长条件的优化研究。我所在实验室首次证实从DJ194中纯化出的△nifZ Av1制备物为FeMoco含量正常(2个)，而P-cluster缺少一半(1个)的、失去一半活性的MoFe蛋白。在厌氧的条件下，用过量的邻菲啰啉(O-phenanthroline，O-phen)螯合其P-cluster中的Fe原子，经计算后，△nifZ Av1分子大约失去8个Fe原子，即为构成一个P-cluster([8Fe-7S]簇)中所有的Fe原子。经Sephadex G-25厌氧柱层析P-cluster金属原子簇中的Fe原子与O-phen螯合，得到完全无活性的△nifZ Av1(?)。但△nifZ Av1(?)，而不是未经O-phen处理的△nifZ Av1，可在Av2-MgATP复合体存在的条件下被含钼重组液显著激活。从△nifZ Av1抽提的FeMoco可在体外激活完全缺失FeMoco而无活性的△nifE Av1和从另一突变株UW45纯化的nifB~-Av1。这表明我们纯化的这两种蛋白的确为正常的缺失FeMoco的固氮菌突变株蛋白。在厌氧的条件下，过量的O-phen也可从这两种蛋白的P-cluster中螯合出Fe原子。经Sephadex G-25柱层析得到△nifE Av1(?)和nifB~-Av1(?)，而不是未经O-phen处理的△nifE Av1和nifB~-Av1，在Av2-MgATP复合体存在条件下也为含钼、含铬和含锰重组液显著激活。上述3种突变株蛋白的体外激活显然需要两个必需条件，即O-phen处理和在Av2及MgATP同时存在。前者也许使蛋白结构松散，而后者则可能使蛋白结构变成

全文目录

摘要  2-4
Abstract  4-6
中文文摘  6-10
第1章绪论  10-28
  1.1 固氮酶的生物化学研究  10-15
  1.2 经典含钼固氮酶的成熟  15-23
  1.3 MoFe蛋白金属原子簇体外拆卸与组装  23-25
  1.4 固氮酶晶体学的研究  25-26
  1.5 选题依据及研究思路  26-28
第2章材料与方法  28-43
  2.1 菌种及培养  28-30
  2.2 厌氧技术  30-31
  2.3 固氮酶提取及纯化  31-37
  2.4 蛋白质浓度测定  37-38
  2.5 固氮酶活性测定  38-40
  2.6 蛋白质电泳及Western Blotting(免疫印迹)  40-41
  2.7 蛋白质结晶  41-43
第3章结果与分析  43-62
  3.1 棕色固氮菌突变株固氮酶△nifZ Av1、△nifE Av1的分离纯化、体外重组和晶体生长研究  43-58
    3.1.1 棕色固氮菌突变株固氮酶△nifZ Av1、△nifE Av1的分离纯化  43-49
    3.1.2 △nifE Av1、nifB~-Av1和△nifZ Av1的体外重组  49-58
  3.2 新型固氮酶CrFe蛋白及MnFe蛋白的分离纯化及初步特性研究  58-62
第4章讨论  62-65
  4.1 固氮菌突变株固氮酶组分Ⅰ蛋白的分离与纯化  62
  4.2 固氮菌突变株固氮酶组分Ⅰ蛋白金属原子簇的体外拆卸与组装研究  62-64
  4.3 固氮菌突变株固氮酶组分Ⅰ蛋白晶体生长的研究  64-65
第5章本研究主要进展与展望  65-68
  5.1 研究进展  65-66
  5.2 研究展望  66-68
附录  68-70
  缩略语  68-70
参考文献  70-80
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  80-82
致谢  82-83
个人简历  83-84
福建师范大学学位论文使用授权声明  84

棕色固氮菌突变株DJ194，DJ35和UW3固氮酶组分Ⅰ蛋白的研究

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