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金雀异黄素对高糖培养的大鼠系膜细胞生长及细胞外基质作用的实验研究

作　者: 孙莉静
导　师: 袁伟杰
学　校: 第二军医大学
专　业: 内科学
关键词: 金雀异黄素细胞增殖细胞凋亡 Ⅳ型胶原纤维连接蛋白 TGF-β 核转录因子绿色荧光蛋白瞬时转染雌激素受体
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

背景：系膜细胞（MC）的增殖、肥大及细胞外基质（ECM）分泌过多是糖尿病肾病（DN）发展的重要环节，转化生长因子β（TGF-β）在DN基质形成中起了重要作用。采取相应措施抑制TGF-β表达，减少基质的生成，有助于延缓病变的发生发展。多年来，人们一直进行着关于DN最佳治疗方案的探索。近年在DN大鼠模型的研究中发现：大豆蛋白替代动物蛋白能减轻DN动物肾脏高滤过和蛋白尿的程度。进一步研究发现大豆蛋白的这些有益作用可能与其中所含的多酚类混合物（大豆异黄酮）有关。金雀异黄素是大豆异黄酮的主要活性成分，有多种生理功能，如调节雌激素受体、抗氧化作用、抑制酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性等。研究认为金雀异黄素对细胞生长的影响可能与其本身浓度和雌激素受体相关。又有文献报道金雀异黄素可抑制肾小球MC Ⅳ型胶原的合成，减少ECM的聚积，可延缓肾小球疾病的进展。非肾研究显示金雀异黄素可抑制TGF-β的活性。目前关于金雀异黄素对DN影响的研究鲜有报道，但许多间接证据提示它对DN可能具有良好的治疗作用。目的：为了研究金雀异黄素对高糖培养下大鼠MC生长及ECM分泌的影响，我们通过观察不同浓度的金雀异黄素对高糖培养下大鼠MC增殖、凋亡的影响，初步探讨其影响细胞生长的可能机制，如高糖环境下NF-κB活性变化及金雀异黄素作用后活性的改变，以及细胞上雌激素受体的分布；同时了解金雀异黄素对ECM合成、TGF-β分泌及TGF-βmRNA表达的影响。为明确金雀异黄素在肾脏疾病治疗中的地位及意义提供实验依据。方法：本实验主要通过体外培养的大鼠MC进行研究。设立低糖对照组（葡萄糖浓度100mg/dl，不加金雀异黄素）和高糖实验组（葡萄糖浓度450mg/dl＋0、1、5、10、30、50μmol·L-1金雀异黄素），分别培养12、24、36、48小时。MTT法检测不同金雀异黄素浓度作用下大鼠MC的OD值，描绘生长曲线。DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪、HE染色和TUNEL末端标记法四种方法检测细<WP=8>胞凋亡情况，并用流式细胞仪检测细胞的凋亡指数（AI）。ELISA法检测细胞培养液上清Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、TGF-β的分泌情况，RT-PCR法检测金雀异黄素对TGF-βmRNA表达的影响，明确量效关系。绿色荧光蛋白真核表达质粒瞬时转染大鼠MC，按最佳转染条件将NF-κB报告基因瞬时转染大鼠MC，荧光素酶检测仪检测低糖和高糖环境下NF-κB的活性，及加入不同浓度金雀异黄素后NF-κB的活性变化，免疫组化法检测大鼠MC上雌激素α、β受体的分布。结果： MTT实验结果显示：实验48小时内，高糖（0μmol·L-1）可刺激MC的增殖（与对照组相比p<0.05），低浓度金雀异黄素（1μmol·L-1）抑制细胞生长作用不显著，5μmol·L-1组细胞生长受到较轻的抑制作用，高浓度金雀异黄素（>5μmol·L-1）可明显抑制细胞生长，且同一浓度随着作用时间的延长，抑制率升高。DNA琼脂糖凝胶电泳显示：作用24小时，对照组、0μmol·L-1组、1μmol·L-1组表现为基因组DNA，5μmol·L-1组出现模糊不清的条带，提示已有凋亡的存在，高浓度组（10μmol·L-1、30μmol·L-1、50μmol·L-1）呈现明显的梯形条带。流式细胞仪证实高浓度金雀异黄素能促进细胞的凋亡，且存在时间依赖和剂量依赖效应，凋亡图象出现亚二倍体峰。HE染色显示10μmol·L-1作用大鼠系膜细胞12小时，大部分细胞形态正常，但细胞贴壁功能稍有下降；作用24小时，部分细胞脱落，变小变圆，少量细胞胞浆空泡形成、染色体浓缩；作用36小时，部分细胞染色体浓缩，胞核固缩；作用48小时，大部分细胞核膜破裂，核固缩，胞浆空泡化。TUNEL末端标记法显示金雀异黄素作用24小时，对照组、0μmol·L-1组、1μmol·L-1组基本无棕染棕黄色颗粒出现，5μmol·L-1组少量出现，而高浓度组则出现较多的棕染棕黄色颗粒。ELISA法显示高糖能促进细胞合成Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白及分泌TGF-β，具有时间依赖和剂量依赖效应。10μmol·L-1组、30μmol·L-1组、50μmol·L-1组能明显抑制ECM的合成与TGF-β的分泌。RT-PCR法显示高浓度金雀异黄素可抑制TGF-βmRNA的表达。绿色荧光蛋白0.2μg与脂质体1.8μg结合时转染效率最高，按此条件将NF-κB报告基因瞬时转染大鼠系膜细胞，经荧光素酶检测仪检测发现在高糖条件下NF-κB活性较低糖增高，加入金雀异黄素后NF-κB活性受<WP=9>到抑制，且金雀异黄素浓度越高，抑制作用越强。免疫组化方法提示大鼠MC上以雌激素β受体分布为主，几乎没有α受体的表达。结论：在体外高糖条件下，大鼠MC在48小时内以增殖为主。一定浓度的金雀异黄素（>5μmol·L-1）可促进大鼠MC的凋亡、抑制其增殖，并减少ECM的合成。金雀异黄素可在蛋白和基因水平抑制TGF-β的分泌，具有时间依赖、剂量依赖效应。在高糖作用下，NF-κB活性增高，金雀异黄素可抑制高糖引起的NF-κB的活性增高；大鼠MC上雌激素受体分布以β受体为主，我们初步认为金雀异黄素对细胞生长的影响可能与抑制NF-κB的活性有关，与雌激素受体的关系尚难明确。

全文目录

英文缩写  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-14
前言  14-16
第一部分金雀异黄素对大鼠系膜细胞增殖及凋亡的影响  16-35
  一、实验仪器、材料与试剂  16-18
  二、方法  18-21
  三、结果  21-32
    （一） MTT法测定金雀异黄素对大鼠系膜细胞增殖的影响  21-22
    （二）金雀异黄素对大鼠系膜细胞凋亡的影响  22-32
      1． DNA电泳  22-23
      2．流式细胞仪  23-26
      3． HE染色检测细胞凋亡  26-28
      4． TUNEL末端标记法检测细胞凋亡  28-32
  四、讨论  32-35
第二部分金雀异黄素对细胞外基质产生及TGF-β分泌的影响  35-45
  一、实验仪器、材料与试剂  35
  二、方法  35-39
  三、结果  39-42
    （一） ELISA法检测细胞培养液上清Ⅳ型胶原含量  39-40
    （二） ELISA法检测细胞培养液上清纤连蛋白含量  40
    （三） ELISA法检测细胞培养液上清TGF-β含量  40-41
    （四） RT-PCR法检测TGF-βmRNA的表达  41-42
  四、讨论  42-45
第三部分金雀异黄素对大鼠系膜细胞生长影响的可能机制  45-51
  一、实验仪器、材料与试剂  45-46
  二、方法  46-47
  三、结果  47-51
    （一）绿色荧光蛋白真核表达质粒瞬时转染大鼠系膜细胞  47-48
    （二）检测NF-κB在高糖作用下的活性变化  48-49
    （三）检测NF-κB在金雀异黄素作用下的活性变化  49
    （四）大鼠系膜细胞雌激素α、β受体检测  49-51
四、讨论  51-55
全文总结  55-56
参考文献  56-62
课题综述  62-73
在读期间发表文章  73-74
致谢  74-81

金雀异黄素对高糖培养的大鼠系膜细胞生长及细胞外基质作用的实验研究

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