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金属硫蛋白基因工程菌的构建及其对重金属响应的研究

作　者: 吕品
导　师: 仪慧兰
学　校: 山西大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 金属硫蛋白 绿色荧光蛋白 工程酵母菌 生物检测 重金属抗性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


随着工业的快速发展,大量的工业废水被排放到环境中,使得水体重金属污染越来越严重,重金属污染不仅对生态平衡构成极大的威胁,还能直接或间接影响人类的健康。金属硫蛋白(MT)的合成受金属离子的诱导,该诱导作用通过调节MT的转录水平实现,MT是一类富含半胱氨酸的蛋白质,其半胱氨酸上的巯基对重金属离子有极强的结合力,能够结合重金属形成无毒或低毒的络合物,具有解除重金属毒性的功能。本文以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建金属硫蛋白重组表达载体转化毕赤酵母,研究工程菌株对重金属胁迫的荧光响应及对重金属的抗性。以酿酒酵母基因组DNA为模板,PCR扩增获得金属硫蛋白启动子Pcup1片段,将其替换载体pPIC9K上原有的启动子PAOXI,构建重组载体pCUP9K;以质粒pYX112-GFP为模板,PCR扩增获得GFP基因序列,插入pCUP9K的多克隆位点,构建重组表达载体pCUP9K-GFP;采用重叠延伸PCR技术,以质粒pGEM-T-AsMT2b和pYX112-GFP为模板,设计特异性引物,分别PCR扩增获得AsMT2b和GFP基因,再将两者准确拼接获得融合基因,构建重组表达载体pCUP9K-AsMT2b-GFP和pPIC9K-AsMT2b-GFP。将构建成功的重组表达载体单酶切线性化,用氯化锂法分别转化毕赤酵母GS115,获得工程菌株GS115-1 (pCUP9K-GFP)、GS115-2 (pCUP9K-AsMT2b-GFP)和GS115-3 (pPIC9K-AsMT2b-GFP)。荧光显微镜下用波长460-480 nm的蓝光照射,可以观察到工程菌菌体发出的绿色荧光,而对照菌没有发出荧光,表明GFP在工程菌中获得正确表达。分离工程菌的发酵上清液,用荧光分光光度计进行扫描,结果显示在激发波长为475 nm时,508 nm处有一发射峰,其光谱特征与GFP一致,表明工程菌能够将胞内表达的GFP分泌至胞外。将工程菌GS115-1置于含有不同重金属(铜、铬、镉、砷)离子的培养液中,在一定时间后检测其发酵上清液的荧光值,结果表明,工程菌对铜离子有明显的荧光响应,且荧光强度与铜离子浓度(0-1000μM)呈正相关,可以通过进一步改进工艺和参数,由工程菌的荧光强度来指示水体中铜离子的相对含量。在培养液中分别添加铜离子和甲醇,对工程菌GS115-2和GS115-3进行诱导,取发酵上清液经SDS-PAGE电泳,检测到目的蛋白AsMT2b-GFP,该结果进一步说明工程菌能够将胞内表达的外源蛋白分泌至胞外。用含不同重金属(铜、铬、镉、砷)的平板培养工程菌GS115-2和GS115-3,检测工程菌对重金属的抗性,结果表明工程菌对铜、铬、镉的抗性明显增强,而对砷的抗性没有明显改善,说明转AsMT2b基因工程菌过表达AsMT2b能够增强宿主对铜、铬、镉的抗性。

全文目录


中文摘要  8-10ABSTRACT  10-12第一章 文献综述  12-21  1 金属硫蛋白  12-15    1.1 MT的结构与性质  12-14    1.2 MT的主要功能  14-15  2 绿色荧光蛋白  15-18    2.1 GFP的结构与性质  15-16    2.2 GFP作为标记分子的优势  16-17    2.3 GFP的主要应用  17-18  3 巴斯德毕赤酵母表达系统  18-20  4 本研究目的及意义  20-21第二章 金属硫蛋白重组表达载体的构建  21-36  1 实验材料和试剂  21-23    1.1 菌株和质粒  21    1.2 工具酶及生化试剂  21    1.3 培养基及主要试剂  21-22    1.4 PCR引物  22-23  2 实验方法  23-30    2.1 重组表达载体构建流程  23-25    2.2 提取酵母基因组DNA  25    2.3 PCR扩增  25-26    2.4 琼脂糖凝胶电泳  26-27    2.5 DNA酶切  27    2.6 DNA连接与转化  27-29    2.7 重组表达载体的鉴定  29-30  3 实验结果  30-35    3.1 重组载体pCUP9K的构建  30-31    3.2 目的基因的PCR扩增  31-32    3.3 载体多克隆位点的酶切  32-33    3.4 重组表达载体pCUP9K-GFP的构建  33    3.5 重组表达载体pCUP9K-AsMT2b-GFP的构建  33-34    3.6 重组表达载体pPIC9K-AsMT2b-GFP的构建  34-35  4 结论  35-36第三章 重组表达载体转化毕赤酵母  36-42  1 实验材料和试剂  36    1.1 菌株和质粒  36    1.2 工具酶及生化试剂  36    1.3 培养基及主要试剂  36  2 实验方法  36-39    2.1 单酶切重组表达载体  36-37    2.2 制备酵母感受态细胞  37-38    2.3 氯化锂法转化酵母细胞  38    2.4 阳性克隆的筛选与鉴定  38    2.5 工程菌的荧光检测  38-39  3 实验结果  39-41    3.1 重组表达载体的线性化  39    3.2 工程菌的构建  39-40    3.3 工程菌中目的基因的表达  40-41  4 结论  41-42第四章 工程菌对重金属胁迫响应的研究  42-51  1 实验材料和试剂  42-43    1.1 菌株  42    1.2 生化试剂  42    1.3 培养基及主要试剂  42-43  2 实验方法  43-45    2.1 重金属对工程菌荧光强度的影响  43    2.2 工程菌的诱导表达  43-45    2.3 重金属对工程菌生长的影响  45  3 实验结果  45-50    3.1 工程菌对重金属的荧光响应  45-47    3.2 工程菌表达目的蛋白  47-48    3.3 工程菌对重金属的抗性  48-50  4 结论  50-51讨论  51-53参考文献  53-60攻读学位期间取得的研究成果  60-61致谢  61-62个人简况及联系方式  62-64

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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