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绵羊卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植

作　者: 张晓建
导　师: 张涌；陈静波
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 发育生物学
关键词: 绵羊卵母细胞体外成熟玻璃化冷冻孤雌激活核移植
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

哺乳动物体细胞核移植是一项复杂而有序的操作过程。本文从不同方面研究了绵羊卵母细胞的体外成熟、孤雌激活以及重构胚的构建过程,建立了一套比较稳定的核移植体系,其结果如下: 1. 分析了EGF 不同添加量、FSH:LH 的不同配比和不同大小卵泡的卵泡液对绵羊卵母细胞的体外成熟的影响。结果表明:(1)添加30ng/ml EGF 显著高于其他试验组的成熟率(85.0% vs 60.0%, 71.7%, 72.7%, P﹤0.05),并可提高绵羊孤雌激活胚的囊胚发育率;(2)成熟液中添加FSH 1μg/ml,LH 5.0IU/ml成熟率最高;(3)在绵羊卵母细胞成熟液中添加3%绵羊大卵泡液,在成熟率上极显著高于小卵泡液的20%添加组(78.6% vs 36.5%,P﹤0.01),显著高于小卵泡液的3%添加组和未添加组(78.6% vs60.0%, 67.5%, P<0.05)。2. 比较了不同发育时期卵母细胞进行OPS 玻璃化冷冻效果及其对以后发育的影响。研究发现,成熟培养0h(GV 期)、16h、24h、26h的卵母细胞玻璃化冷冻、解冻后形态正常率差异不显著(P>0.05),培养24h卵母细胞冷冻保存后,卵裂率、囊胚率与培养0h、16h、26h试验组差异显著(38.3% vs 13.3%、26.7%、28.3%;13.0% vs 0%、6.3%、5.9%,P<0.05),而培养16h、26h两个试验组之间差异不显著(P>0.05)。结果表明:成熟培养24h的卵母细胞OPS玻璃化冷冻效果最好,成熟培养16h、26h 次之,而不经过成熟培养的卵母细胞玻璃化冷冻效果最差。3. 研究了不同化学激活方法对绵羊孤雌生殖胚胎发育的影响。在囊胚率上,Ionomycin联合6-DMAP 与联合6-DMAP +CB差异不显著,而与联合CB 组差异显著(P<0.05),与单独Ionomycin 激活差异极显著(P<0.01);乙醇联合6-DMAP+CB与联合6-DMAP、CB 差异显著(P<0.05),而与单独乙醇激活差异极显著(P<0.01)。结果表明: Ionomycin+6-DMAP 、Ionomycin+6-DMAP +CB与乙醇+6-DMAP +CB在绵羊卵母细胞孤雌激活上都可获得较好的效果,其中以乙醇+6-DMAP +CB组为最佳。4. 比较了不同电激活参数对绵羊孤雌生殖胚胎发育的影响。结果发现:1.2 Kv/cm 的直流脉冲具有最佳激活效果,与1.6 Kv/cm 组差异不显著,但与0.8 Kv/cm、2.0 Kv/cm 组在卵裂率、囊胚率上差异显著。脉冲次数3 次效果最好,其卵裂率、囊胚率显著高于2 次脉冲( P<0.05 ),与1 次脉冲差异极显著(P<0.01)。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-13
综述部分  13-37
  第一章哺乳动物核移植研究进展  13-37
    1.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展  13-14
    1.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展  14-15
    1.3 胚胎干细胞核移植研究进展  15-16
    1.4 转基因克隆动物研究进展  16
    1.5 种间细胞核移植研究进展  16-17
    1.6 哺乳动物核移植有关机理研究进展  17-24
      1.6.1 细胞核、细胞质及其互作  18-22
      1.6.2 细胞周期  22-24
    1.7 核移植操作本程序与影响因素  24-31
      1.7.1 核受体胞质的准备及其对核移植结果的影响  24-25
      1.7.2 核供体的准备及其对核移植结果的影响  25-27
      1.7.3 卵母细胞去核方案及其对核移植结果的影响  27-29
      1.7.4 融合-激活方案及其对核移植结果的影响  29-30
      1.7.5 核移植方案及其对核移植结果的影响的影响  30
      1.7.6 重组胚培养方案及其对核移植效率的影响  30-31
    1.8 体细胞核移植技术的应用前景  31-32
    1.9 细胞核移植存在的问题  32-35
    1.10 结语  35-37
实验部分  37-56
  第二章绵羊卵母细胞体外成熟与孤雌激活  37-49
    2.1 材料  38
    2.2 方法  38-40
      2.2.1 绵羊卵母细胞的采集  38
      2.2.2 COCS的体外成熟  38
      2.2.3 OPS玻璃化冷冻操作步骤  38-39
      2.2.4 卵母细胞的孤雌激活  39
      2.2.5 孤雌激活胚的体外培养  39
      2.2.6 试验设计  39-40
      2.2.7 试验数据的统计分析  40
    2.3 结果  40-43
      2.3.1 EGF对卵母细胞成熟及孤雌发育的影响  40-41
      2.3.2 不同激素配比对绵羊卵母细胞体外成熟的影响  41
      2.3.3 不同直径绵羊卵泡的卵泡液对绵羊卵母细胞成熟及孤雌发育的影响  41
      2.3.4 不同发育时期卵母细胞进行OPS法冷冻效果的比较  41-42
      2.3.5 IONOMYCIN的不同组合激活方式对绵羊孤雌胚胎发育效果的影响  42
      2.3.6 乙醇的不同组合激活方式对绵羊孤雌胚胎发育效果的影响  42
      2.3.7 电激活时不同场强对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响  42
      2.3.8 不同脉冲次数对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响  42-43
    2.4 讨论  43-46
    2.5 小结  46-49
  第三章卵母细胞去核时期对绵羊核移植效率的影响  49-56
    3.1 材料和方法  49-51
      3.1.1 试剂及培养液的配制  49
      3.1.2 绵羊卵巢的采集、运输及绵羊卵母细胞的采集、体外成熟  49
      3.1.3 供体细胞的准备  49-50
      3.1.4 成熟卵母细胞的去核  50
      3.1.5 核移植  50
      3.1.6 克隆胚胎的激活  50-51
      3.1.7 克隆胚胎的体外培养  51
      3.1.8 试验设计及统计分析  51
    3.2 结果  51-53
      3.2.1 不同成熟时间卵母细胞去核效率的比较  51-52
      3.2.2 不同时期卵母细胞去核效率的比较  52
      3.2.3 去核卵母细胞高渗处理对绵羊带下注核核移植效率的影响  52
      3.2.4 卵丘/颗粒细胞的血清饥饿处理对核移植效率的影响  52-53
    3.4 讨论  53-55
    3.5 小结  55-56
结论  56
以后研究的方向  56-57
参考文献  57-68
附录1  68-71
附录2  71-73
致谢  73-75
个人简历  75

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