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孤雌激活人体外成熟卵母细胞和人孤雌胚胎干细胞建系的初步探讨

作　者: 金丹
导　师: 张云山
学　校: 天津医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 孤雌激活卵母细胞胚胎干细胞饲养层胚胎培养
分类号: R714.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)是指从人囊胚期分离内细胞团(inner cell mass, ICM)能在体内长期增殖并保持未分化,同时具有多向分化潜能的一类细胞。近年来,关于hESCs诱导分化为表皮样干细胞、神经细胞、造血干细胞、心肌细胞等方面的研究取得一定的进展。成功建立的hESCs系已被广泛应用于生命科学的许多领域,它潜在的医学应用也成为世界范围内的研究热点。目前,人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stem cells, hPESCs)系的成功建立为hESCs建系提供崭新的来源,是预防移植细胞免疫排斥的潜在方法。但是人成熟卵母细胞来源十分有限,我们试图采用新的卵母细胞资源获得孤雌发育的胚胎,初步探讨hPESCs建系和鉴定的相关内容。本研究在人卵母细胞来源、孤雌激活条件、hPESCs的培养体系的建立等方面为应用孤雌生殖技术建立hPESCs系提供了新的思路。目的：了解电脉冲联合6-甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine,6-DMAP)孤雌激活人体外成熟卵母细胞后,获得的孤雌胚胎的发育潜能；初步探讨hPESCs的建系与鉴定工作。方法：未见第1极体排出的不成熟人卵母细胞,经过在体外受精(in vitro fertilization, IVF)培养液中体外培养,共获得减数分裂Ⅱ期(MⅡ)成熟卵母细胞117个,随机分两组。处理组成熟卵母细胞予以电脉冲联合6-DMAP孤雌激活,共59个；对照组不予人工孤雌激活,共58个；对比观察两组活化效率和胚胎早期的体外发育效率；继续观察并筛选发育至囊胚阶段的孤雌胚胎,机械法分离ICM,原代克隆培养。建立hPESCs的培养方法：将hPESCs接种在经过丝裂霉素C(Mitomycin C, MMC)处理的人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts, HFF)上,培养基含80%KnockOut-DMEM、20%Knock-Out血清替代物(Knockout serum replacement, KSR)及8ng/mL碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growth factor, bFGF)等,用0.05%胰酶(0.05%trypsin-EDTA)消化细胞进行连续传代,经特异性标记物染色与核型检测达到鉴定hPESCs的目的。结果：1、电脉冲联合6-DMAP孤雌激活人体外成熟卵母细胞,处理组活化率为32.20%,对照组活化率为12.07%,处理组活化率明显高于对照组,组间差异有统计学意义(P<0.05)。2、处理组卵裂率为21.10%,囊胚形成率为25.00%；对照组卵裂率为57.10%,囊胚形成率为0.00%。经过统计学分析,对于处理组和对照组的卵裂率、囊胚形成率来说,组间差异无统计学意义(P>0.05)。3、处理组中的1个电脉冲联合6-DMAP孤雌激活的孤雌胚胎发育至囊胚阶段,分离ICM、原代培养并接种于HFF饲养层上,可以使hPESCs呈克隆样生长,命名为hPESCs-081012,利用本研究建立的hPESCs培养体系,体外长期扩增超过20代,生物学鉴定符合hESCs标准。4、hPESCs特异性标记物免疫组化染色在HFF饲养层上生长的hPESCs克隆,抗Oct-4抗体免疫组化染色呈绿色荧光,抗SSEA-3抗体和抗SSEA-4抗体染色呈红色荧光,抗SSEA-1抗体染色未见明显荧光显色。5、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP)染色AP染色可见hPESCs克隆呈蓝紫色着色,而HFF饲养层细胞未见着色6、核型检测hPESCs-081012细胞系体外培养20余代,核型保持正常：46,ⅩⅩ。结论：电脉冲联合6-DMAP能够有效孤雌激活人体外成熟卵母细胞。本研究成功建立适合的HFF饲养层与HPESCs培养体系,维持HPESCs-081012保持高度增殖及不发生自发分化的特性。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-9
符号说明  9-11
前言  11-13
  研究现状、成果  11
  研究目的、方法  11-13
一、利用人体外成熟卵母细胞获得孤雌活化胚胎的研究  13-29
  1.1 对象和方法  13-15
  1.2 结果  15-16
  1.3 讨论  16-19
  1.4 小结  19-20
  附图  20-29
二、人孤雌胚胎干细胞建系的初步探讨  29-53
  2.1 对象和方法  29-37
  2.2 结果  37-38
  2.3 讨论  38-43
  2.4 小结  43-44
  附图  44-53
结论  53-54
参考文献  54-58
发表论文和参加科研情况说明  58-59
综述  59-70
  孤雌生殖与孤雌胚胎干细胞的研究进展  59-66
  综述参考文献  66-70
致谢  70

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