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卵泡直径对猪卵母细胞胞质成熟的影响

作　者: 刘仲凤
导　师: 刘忠华
学　校: 东北农业大学
专　业: 发育生物学
关键词: 卵泡直径 卵母细胞体外成熟 核成熟 胞质成熟 猪
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 58次
引　用: 1次
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内容摘要


获取高质量的体外成熟卵母细胞是成功进行哺乳动物体外受精、胚胎生产和克隆的关键,在体内,卵母细胞的受精与发育能力是伴随着卵泡由小到大的生长过程逐渐获得的,由此推测卵泡直径可能是卵母细胞体外成熟质量的关键性影响因素。因此本文以猪卵巢为研究对象,按直径将卵巢表面卵泡分为两组:4-7mm(G1,含有4mm)组和2-4mm(G2,不包含4mm)组,在体外成熟培养前后,以核成熟为辅助,着重以孤雌发育能力、卵丘扩展及相关基因表达、卵母细胞线粒体拷贝数、谷胱甘肽含量等为主要依据研究了卵泡直径对卵母细胞胞质成熟的影响。实验结果如下:1)卵泡直径对卵母细胞核成熟的影响:将不同直径卵泡来源的卵母细胞分组抽取并培养,42h后,以第一极体的排出作为核成熟的检测标准,发现G1组核成熟率显著高于G2组(95.06%vs68.19%,P<0.05)。2)卵泡直径对卵母细胞胞质成熟的影响(1)对来源于不同直径卵泡的核成熟卵母细胞进行电脉冲刺激,获得孤雌胚胎,经体外培养后发现,G1组囊胚率显著高于G2组(51.47%vs29.44%,P<0.05),但组间囊胚细胞数差异不显著。(2)利用Realtime PCR分别在体外成熟培养的0h、24h、42h对转化生长因子家族基因Gdf9,Bmp15, Bmpr2和卵丘扩展标志基因Has2, Ptgs2, Ptx3l及孕酮受体Pgr的表达进行了研究,结果发现,在卵母细胞体外成熟培养过程中,Gdf9, Bmp15, Bmpr2的表达在组间差异不显著。G1组的卵丘扩展相关基因Has2, Ptgs2, Ptx3l及孕酮受体Pgr的表达水平显著高于G2组(P<0.05)。(3)利用绝对定量PCR,对卵母细胞线粒体拷贝数进行检测发现G1组的卵母细胞线粒体含量显著高于G2组(P<0.05),但在体外成熟培养前后,两组的卵母细胞线粒体拷贝数无显著变化。(4)应用DTNB(5,5′-dithiobis-2-nitrobenzoic acid, 5, 5′-二巯基-2-硝基苯酸)酶循环法对体外成熟培养的0h、24h、42h的两组卵母细胞总谷胱甘肽(tGSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量进行检测后发现,同一组内的卵母细胞中tGSH、GSSG和GSH含量在成熟培养过程中显著减少,不同直径卵泡来源的卵母细胞间tGHS和GSH含量差异显著,而GSSH含量两组间差异不显著。结果表明:卵泡直径除对卵母细胞核成熟率有显著影响外,在卵丘扩展、线粒体拷贝数、谷胱甘肽含量等胞质成熟指标方面均产生影响,进而影响孤雌胚胎发育能力。

全文目录


中文摘要  8-9
英文摘要  9-11
1 引言  11-20
  1.1 卵泡与卵母细胞  11-13
    1.1.1 卵泡发育与卵母细胞成熟  11-12
    1.1.2 卵泡直径与卵母细胞发育能力的研究进展  12-13
  1.2 胞质成熟的研究现状  13-14
  1.3 线粒体与卵母细胞胞质成熟  14
  1.4 谷胱甘肽与卵母细胞胞质成熟  14-15
  1.5 卵丘与猪卵母细胞成熟、受精、发育  15-19
    1.5.1 卵丘与卵母细胞成熟  15-16
    1.5.2 卵母细胞成熟过程中COC 的形态改变  16-17
    1.5.3 卵丘扩展相关基因研究进展  17-19
  1.6 研究目的和意义  19-20
2 材料与方法  20-28
  2.1 卵母细胞的分组收集  20
  2.2 卵母细胞成熟培养  20
  2.3 孤雌激活及体外发育  20-21
  2.4 绝对定量PCR 法检测单卵内线粒体含量  21-22
    2.4.1 标准曲线制作  21-22
    2.4.2 线粒体含量检测用单卵准备  22
  2.5 卵母细胞谷胱甘肽含量检测  22-24
  2.6 Realtime-PCR 检测卵丘卵母细胞相关基因表达  24-26
    2.6.1 RNA 提取用样品准备  24-25
    2.6.2 RNA 提取  25
    2.6.3 RNA 反转成cDNA  25-26
    2.6.4 Realtime-PCR  26
    2.6.5 Realtime PCR 引物设计合成  26
    2.6.6 Realtime-PCR 结果相对表达量的分析  26
  2.7 统计分析  26-28
3 结果与分析  28-37
  3.1 卵泡直径对猪卵母细胞体外核成熟及孤雌发育的影响  28
  3.2 卵丘扩展  28-32
    3.2.1 不同直径卵泡来源的卵丘卵母细胞复合体成熟培养前后卵丘状态比较  28
    3.2.2 卵丘扩展相关基因在卵丘细胞中表达  28-29
    3.2.3 转化生长因子家族基因在卵丘卵母细胞中的表达分析  29-32
  3.3 绝对定量 PCR 检测卵母细胞线粒体拷贝数  32-34
    3.3.1 线粒体标准曲线制作  32-33
    3.3.2 卵母细胞线粒体拷贝数分析  33-34
  3.4 卵母细胞谷胱甘肽含量检测  34-37
4 讨论  37-41
  4.1 卵泡直径与卵母细胞体外发育能力  37
  4.2 卵泡直径对卵丘扩展的影响及调控机制  37-39
  4.3 卵泡直径与卵母细胞胞质成熟  39-41
    4.3.1 胞质成熟与线粒体拷贝数  39
    4.3.2 胞质成熟与谷胱甘肽含量  39-41
5 结论  41-42
致谢  42-43
参考文献  43-48
附录  48-52
攻读学位期间发表的学术论文  52

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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