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牛卵母细胞冷冻保存与体外孤雌培养技术研究

作　者: 倪明
导　师: 张居农；吕自立
学　校: 石河子大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 冷冻损伤牛卵母细胞孤雌激活荷斯坦牛
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

随着体外受精-胚胎移植(Invitro fertilization embryo transplantation, IVF-ET)和冷冻技术的发展,冷冻技术在动物种质资源的保存上得以推广应用,虽然卵母细胞的冷冻方法在不断发展,但是由于冷冻后受到一定的损伤,对其后的发育会产生一定的影响。尤其是卵母细胞在冷冻后,再进行孤雌培养是充分利用卵母细胞的一个重要部分。这对充分利用屠宰场里大量的荷斯坦牛卵母细胞有一定帮助。本研究探讨了冷冻后卵母细胞的成熟与孤雌激活,以及冷冻处理对孤雌激活的影响。本研究分为三个实验,研究结果如下。试验一不同冷冻方法对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响1.冷冻后卵母细胞形态正常率、卵裂率、囊胚率与对照组差异极显著(P<0.01),卵裂率及囊胚率小于对照组,说明冷冻处理对卵母细胞有一定的损伤,对卵母细胞后续的激活,培养均有一定的影响。本研究观察到,麦管法与OPS法差异极显著(P<0.01),OPS法冷冻的卵母细胞形态正常率、卵裂率、囊胚率均显著比麦管法冷冻要高,说明OPS法可以有效地保护卵母细胞,保证其后孤雌激活,冷冻程序对卵母细胞造成的影响较小(P>0.05)。2.冷冻后卵母细胞形态正常率、卵裂率、囊胚率与对照组相比,差异极显著(P<0.01)。而保护剂1与保护剂2之间差异不显著,但保护剂2比保护剂1的要高,说明保护剂2对牛卵母细胞的保护能力比保护剂1效果要好,而保护剂1的卵母细胞卵裂率要略高与保护剂2(P>0.05)。3.OPS法平衡温度38℃与25℃相比,差异不显著。在38℃时,卵母细胞形态正常率、卵裂率、囊胚率均略高于25℃。实验结果表明,在38℃与25℃之间平衡温度,对冷冻后卵母细胞孤雌发育的影响不大。本实验证实,38℃、25℃时与4℃相比,差异极显著,当平衡温度明显降低后,会对卵母细胞的孤雌发育造成显著的影响,平衡温度不宜低于25℃。在4℃时,冷冻后的卵母细胞激活后出现囊胚,实验结果表明低温平能温度对孤雌发育的囊胚阶段有较大影响。试验二不同培养条件对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响1.在成熟培养液中添加不同浓度卵泡液,发现：添加0%-20%的卵泡液,对卵母细胞孤雌激活后的卵裂率没有明显影响(P>0.05)；添加10%,20%的卵泡液卵母细胞孤雌激活后,囊胚发育率(14.6%,14.8%)明显高于添加5%和0%组(10.9%,11.4%,P<0.05),结果表明,在成熟培养液中添加10%,20%卵泡液对卵母细胞的成熟与随后的囊胚发育有促进作用。2.本试验分别用三蒸水和Mill—Q超纯水配制的培养液培养牛孤雌激活胚胎,结果表明,卵母细胞成熟率(PbI排放率)和卵裂率及囊胚率等无显著影响(P>0.05)。水并不是影响孤雌激活胚胎发育的关键因素,只要水质干净,符合培养用水就不会给随后的培养造成较大影响。试验三不同作用时间对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响1.试验结果表明,体外成熟24 h—30 h的卵母细胞,激活后卵裂率差异不显著(P>0.05),但随着成熟时间延长,卵裂率有上升趋势。卵母细胞成熟28 h或30h囊胚的发育率为(16.4%,15.3%)明显高于成熟24 h或26 h的囊胚发育率(10.5%,9.8%.P<0.05)。卵母细胞随着成熟时间的延长,卵母细胞得到较为充分的成熟过程,成熟卵母细胞数量就会增多,这可能就是卵母细胞激活后囊胚率提高的另一个因素。2.本实验研究结果证实,牛成熟卵母细胞用离子霉素激活5 min,再用6-DMAP激活2h,卵裂率显著低于激活4h,6h组(P<0.05),6—DMAP作用时间为4h或6h的囊胚发育率明显高作用于2h或8h的囊胚发育率(P<0.05)。结果表明,卵母细胞成熟28h后,用5 um ionomycin培养液激活5 min,然后在含有2mM在6—DMAP的培养液培养4h—6h为宜。激活4h与6—DMAP激活时间6h相比差异不显著。6—DMAP作用时间为8h,囊胚发育率有下降趋势。表明6—DMAP作用时间对牛成熟卵母细胞的激活效率有影响。本试验认为,离子霉素联合6—DMAP激活牛卵母细胞,6—DMAP作用时间以4-6 h为宜。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
目录  10-12
本文缩写的中英文对照  12-13
前言  13-14
第一章文献综述  14-23
  1 低温冷冻的方法和细胞损伤假说  14-16
    1.1 低温冷冻方法  14-15
    1.2 细胞损伤假说  15-16
  2 卵母细胞超低温冷冻保存研究概况  16-19
    2.1 超低温冷冻保存对卵母细胞生存能力的影响  17-18
    2.2 影响卵母细胞冷冻的因素  18-19
    2.3 卵母细胞冷冻的前景及展望  19
  3 卵母细胞孤雌激活及体外培养  19-23
    3.1 卵母细胞孤雌激活的机制  19-20
    3.2 卵母细胞孤雌激活方法  20-22
    3.3 孤雌激活胚胎的发育  22-23
第二章试验研究  23-37
  试验一冷冻方法对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响  23-29
    1 材料与方法  23-25
      1.1 试验材料  23
      1.2 试验试剂  23
      1.3 仪器与设备  23
      1.4 配制试剂  23-24
      1.5 试验方法及步骤  24-25
    2 试验结果  25-27
      2.1 冷冻方法对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的影响  25
      2.2 OPS法中保护剂种类对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的影响  25-26
      2.3 OPS法中平衡温度对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的影响  26-27
    3 讨论  27-28
      3.1 冷冻方法对牛卵母细胞孤雌发育的影响  27
      3.2 OPS法中保护剂种类对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的影响  27
      3.3 OPS法中平衡温度对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的影响  27-28
    4 结论  28-29
  试验二培养条件对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的影响  29-33
    1 材料与方法  29-30
      1.1 试验材料  29
      1.2 试验试剂  29
      1.3 仪器与设备  29
      1.4 配制试剂  29
      1.5 试验方法及步骤  29-30
    2 试验结果  30-31
      2.1 卵泡液对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的影响  30-31
      2.2 水质对冷冻后卵母细胞孤雌发育的影响  31
    3 讨论  31-32
      3.1 卵泡液对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的影响  31
      3.2 水质对冷冻后卵母细胞孤雌发育的影响  31-32
    4 结论  32-33
  试验三成熟时间和孤雌激活时间对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的影响  33-37
    1 材料与方法  33-34
      1.1 试验材料  33
      1.2 试验试剂  33
      1.3 仪器与设备  33
      1.4 配制试剂  33
      1.5 试验方法及步骤  33-34
    2 试验结果  34-35
      2.1 成熟时间对牛卵母细胞孤雌发育的影响  34-35
      2.2 6—DMAP作用时间对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的影响  35
    3 讨论  35-36
      3.1 成熟时间对冷冻后卵母细胞孤雌发育的影响  35-36
      3.2 6—DMAP作用时间对冷冻后牛卵母细胞孤雌发育的影响  36
    4 结论  36-37
参考文献  37-44
附表  44-45
致谢  45-46
作者简介  46-47
导师评阅表  47

牛卵母细胞冷冻保存与体外孤雌培养技术研究

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