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结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗的粘膜免疫及机制研究

作　者: 刘晔华
导　师: 朱道银
学　校: 重庆医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 结核分枝杆菌 pcD85B 粘膜免疫
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

目的: 本研究拟构建编码结核分枝杆菌 H37Rv Ag85B DNA 疫苗,一方面将该疫苗经小鼠鼻粘膜免疫,探讨其在小鼠体内诱导的免疫应答及机制;另一方面研究在 BCG初免后,将该疫苗滴鼻免疫进行增强免疫所诱导的免疫应答及机理。以上设计试图为结核病疫苗寻找最佳免疫途径和方案,为结核病的粘膜免疫防治提供理论和实验依据。方法: 1、用 PCR 和基因克隆技术构建真核表达质粒 pcD85B,Ag85B 编码基因亚克隆入原核表达质粒 pET32a 中, 纯化重组的 Ag85B 蛋白,制备 Ag85B 抗血清; pcD3.1(+)、pcD85B、转染 COS-7 细胞,用 RT-PCR、ELISA 和斑点印迹的方法鉴定目的基因的表达;pcD3.1(+)、pcD85B 免疫 C57BL/6 小鼠,ELISA 法测量免疫后相应的 PPD 特异性抗体和脾淋巴细胞 IL-4 以及 IFN-γ分泌水平,MTT 法检测 PPD 特异性脾淋巴细胞增殖能力,评价 DNA 疫苗的免疫原性。 2、将 PBS、pcD3.1、pcD85B(滴鼻时溶于 PBS 或者以脂质体包裹)分别以肌注和滴鼻免疫 C57BL/6 小鼠,采用 ELISA 法测量免疫后相应的 PPD 特异性抗体和脾淋巴细胞 IL-4 以及 IFN-γ分泌水平; CTL 试验评估小鼠 CD8+T 细胞的杀伤活性。 3、C57BL/6 小鼠分三组,一组皮下接种 BCG,另外两组在 BCG 接种 14 周后, 分别以脂质体包裹的 pcD3.1、pcD85B 滴鼻进行增强免疫;采用 ELISA 法测量免疫后相应的 PPD 特异性抗体和脾淋巴细胞 IL-4 以及 IFN-γ分泌水平; CTL 试验评估小鼠 CD8+T 细胞的杀伤活性。结果:1、经过限制性内切酶酶切及DNA双向测序证实pcD85B真核表达质粒构建成功;用重组的 Ag85B 蛋白制备的鼠抗 Ag85B 血清效价为 1:64;重组质粒 4转染 COS-7 细胞后, Ag85B 多克隆抗体通过 ELISA 法检测到细胞培养上清液 Ag85B 的表达,对照组为为阴性反应;pcD85B 免疫 C57BL/6 小鼠, 末次免疫后 4 周各组 PPD 特异性抗体水平均有不同程度增高,脾淋巴细胞PPD 特异性 IFN-γ分泌水平以及脾淋巴细胞增殖能力均增高。2、脂质体包裹的 pcD85B 滴鼻途径①可诱导局部粘膜免疫 BALF 中的 sIgA 抗体滴度最高(P<0.05),但血清中 IgA 的抗体滴度不高;②可诱导产生 Th1型细胞免疫。该组 IFN-γ水平较高,与同样用脂质体包裹的载体对照比,有显著差异(P<0.05),与肌注组无显著差异(P>0.05),低于 BCG 组(P<0.05)。溶于 PBS 的 DNA 疫苗组 IFN-γ水平非常低,低于载体对照组、肌注组和 BCG 组(P<0.05)。该组 IL-4 水平很低,与肌注组、阳性对照BCG 组、以及生理盐水 DNA 滴鼻组相比,都有显著差异(P<0.05)。该试验组 IgG2a 抗体滴度较高,和肌注组、阳性对照 BCG 组相比无显著差异(P>0.05);与生理盐水 DNA 滴鼻组有显著差异(P<0.05)。③体液免疫较弱血清 IgG 抗体水平低于肌注组和 BCG 组。④CTL 试验通过不同组别颗粒酯酶分泌百分率(%)来反映细胞毒性 T 细胞的功能。该指标在不同免疫途径区别不大,除与 PBS 对照有区别外,与载体对照差别甚微。3、 BCG 皮下初免,pcD85B 滴鼻增强的方案强于单纯 BCG 皮下免疫对照组,表现在①粘膜免疫它的 BALF 中的 sIgA 抗体滴度高于 BCG 组(P<0.05)。②体液免疫该组的特异性 IgG 抗体滴度略低于 BCG 组 ③Th1 型细胞免疫检测 PPD 刺激的脾淋巴细胞培养上清,其 IFN-γ 水平稍低于 BCG 组,但明显高于 pcD85B 肌注组;IL-4 水平明显低于 BCG 组和肌注组,特异性 IgG2a的抗体滴度高于 BCG 组(P<0.05)。④细胞杀伤活性通过不同组别颗粒酯酶分泌百分率(%)来反映细胞毒性 T 细胞的功能。该组颗粒酯酶分泌百分率 86.3946%,低于 BCG 组的 93.3333%。结论:1、 pcD85B 疫苗构建成功, 能在 COS-7 细胞中分泌表达,可诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫。2、脂质体包裹的 DNA 疫苗组与同等剂量的肌注组产生的系统免疫差别不大,弱于 BCG 组;溶于 PBS 的 DNA 疫苗组弱于同等剂量的脂质体组和肌注组,也弱于 BCG 组;DNA 疫苗可以进行滴鼻尝试。

全文目录

英文缩略语表  4-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
前言  12-14
第一部分 pcD858 质粒的构建、表达和免疫原性的鉴定  14-24
  实验材料及方法  14
  实验结果  14-22
  讨论  22-24
第二部分脂质体对pcD858 滴鼻免疫的佐剂作用  24-39
  实验材料  24-25
  实验方法  25-29
  统计学分析  29
  实验结果  29-35
  讨论  35-39
第三部分 BCG 初次免疫，pcD858 滴鼻增强免疫之黏膜免疫效果  39-53
  实验材料  39-40
  实验方法  40-41
  统计学分析  41-42
  实验结果  42-50
  讨论  50-53
参考文献  53-59
综述重组卡介苗的研究进展  59-65
致谢  65-66
攻读硕士学位期间发表的学术论文  66

结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗的粘膜免疫及机制研究

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