学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

结核分枝杆菌Rv1096的表达及功能鉴定

作　者: 周慧
导　师: 马郁芳
学　校: 大连医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 结核分枝杆菌 Rv1096 肽聚糖脱乙酰基酶
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 15次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)能够感染宿主并在宿主体内长期存活,其细胞壁起着重要的作用。结核分枝杆菌细胞壁核心结构由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖组成。肽聚糖是由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸交替连接形成的多糖链与短肽链交叉连接形成网状大分子结构,以维持细胞的形状。结核分枝杆菌细胞壁中还含有一些蛋白质和酶,研究细胞壁蛋白和酶有助于我们深入理解结核分枝杆菌对宿主细胞的感染机制、细菌的存活及对宿主的免疫调节以及细胞壁大分子的合成与降解规律等。Rv1096是一种结核分枝杆菌细胞壁蛋白。生物信息学分析显示,Rv1096与肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的肽聚糖N-乙酰葡糖胺脱乙酰基酶(PgdA)具有31% (76/243)一致性。研究发现,由于肺炎链球菌PgdA对肽聚糖N-乙酰葡糖胺的脱乙酰基作用,脱乙酰基的肽聚糖使细菌能够抵抗溶菌酶的降解作用,使细菌在宿主内存活。在本研究中,我们将对结核分枝杆菌Rv1096进行功能鉴定。目的:(1)用高保真DNA聚合酶从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1096基因,并将其克隆到pMD18-T载体中; (2)构建pET29b-Rv1096表达载体,在E. coli BL21(DE3)pLysS中表达结核分枝杆菌Rv1096蛋白;(3)采用亲和层析技术纯化Rv1096蛋白,并用SDS-PAGE以及Western blotting鉴定所纯化的Rv1096蛋白;(4)对Rv1096的功能进行鉴定。结果:1.克隆Rv1096基因用高保真DNA聚合酶(PrimeStar)从结核分枝杆菌H37R基因组中扩增出Rv1096基因,将纯化Rv1096基因克隆到pMD18-T载体中,构建出pMD18-Rv1096。用限制性内切酶NdeI鉴定并进行DNA测序。2.构建pET29b-Rv1096表达载体经DNA测序鉴定后,将序列正确的Rv1096基因亚克隆到pET29b质粒,构建出pET29b-Rv1096重组表达质粒。将pET29b-Rv1096转化到E. coliBL21(DE3)pLysS菌株中。3.诱导Rv1096蛋白在E. coli BL21(DE3)pLysS中的表达用2.5 mM IPTG,在18℃振荡培养12小时,诱导E. coli BL21(DE3)pLysS表达重组Rv1096蛋白。用超声法破碎细菌,对上清组分进行Western blotting分析。结果表明,在上清中存在表达的Rv1096蛋白,分子量为31.08 kD。4.采用亲和层析技术纯化Rv1096蛋白pET29b表达载体使重组Rv1096蛋白C端带有组氨酸标签,因此,用组氨酸-Ni2+亲和层析技术对Rv1096蛋白进行纯化。用Western blotting分析洗脱组分1、2,结果表明,纯化所得的蛋白为Rv1096蛋白。用考马斯亮蓝法定量洗脱组分1的浓度为53.78μg/ml,该组分用于酶活性分析。5.建立脱乙酰基酶活性的测定方法将纯化的Rv1096蛋白与耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)胞壁肽底物在37℃下反应3 h,用乙酸检测试剂盒测定乙酰基。如果Rv1096具有脱乙酰基酶活性,将使肽聚糖脱乙酰基,乙酰基进一步转变成乙酸,后者与试剂盒中各组分经过一些列的反应生成NADH+H+,在340 nm处测定NADH+H+量。结果表明,Rv1096具有脱乙酰基酶活性。结论:在本研究中,我们构建了pET29b-Tb Rv1096表达载体,在E. coli BL21(DE3)pLysS中表达出可溶性的Rv1096蛋白。并用乙酸试剂盒测定了Rv1096蛋白的肽聚糖脱乙酰基酶活性。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-11
材料和方法  11-18
结果  18-23
讨论  23-28
结论  28-29
参考文献  29-31
综述  31-46
  参考文献  43-46
附录  46-47
  在读期间参加的专业学术会议  46-47
致谢  47-48

相似论文

中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
© 2012 www.xueweilunwen.com