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结核分枝杆菌及耐药结核分枝杆菌快速的检测研究

作　者: 武洁
导　师: 徐飚
学　校: 复旦大学
专　业: 公共卫生
关键词: 恒温扩增防污染快速结核分枝杆菌荧光PCR 突变耐药
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

1.研究背景结核病是当今世界对人类健康最具威胁的传染病之一,中国是22个结核病高负担国家之一,患病人数位居世界第二位,我国有近一半人口(约5.5亿人)感染了结核分枝杆菌,全国现有肺结核病人451万,同时每年因结核病死亡约有13万人,是各种传染病和寄生虫病死亡总和的2倍,因此结核病的防治仍是刻不容缓的任务。耐药结核病,尤其是耐多药(MDR)结核病和广泛耐药(XDR)结核病的出现更是给全球结核病控制带来了严重的挑战,已成为结核病研究和控制领域亟待解决的难点之一。结核分枝杆菌生长缓慢的特性一直以来限制了临床对患者的及时诊断及治疗,寻找一种特异、敏感、早期、快速、简便的结核病及耐药结核病快速诊断方法是结核病控制的重要任务之一2.研究目的通过评估恒温扩增-防污染核酸试纸条在快速检测结核分枝杆菌中的应用,以及结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂盒在快速检测耐药结核分枝杆菌中的可行性,为基层医疗单位建立了一种简便、快速、可靠的结核分枝杆菌及耐药结核分枝杆菌快速检测方法,为临床早期诊断提供了有利信息,及时发现和治疗结核病人,同时大大缩短了临床对耐药结核病的早期诊断和正确治疗方案的制定,对控制耐药结核病的流行与传播有重大意义。3.研究设计本研究通过收集上海市某结核病定点医疗机构肺科门诊就诊结核病患者痰液样本465例对其进行痰涂片抗酸染色、Lowenstein-Jensen(L-J)培养、Bactec MGIT/960 System (MGIT/960)液体培养及交义引物恒温扩增技术检测痰液中的结核分枝杆菌,评估该恒温扩增技术在结核分枝杆菌的早期诊断中的应用的可行性。研究还从上海市疾病预防控制中心结核病实验室2004年3月至2008年11月所收集MDR结核病人的结核分枝杆菌菌株中随机抽取158株,通过结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂盒检测判断菌株是否存在与异烟肼、利福平及乙胺丁醇耐药相关的常见基因突变,与DNA测序结果相比对,评估其作为临床耐药结核分枝杆菌感染诊断和早期确诊的诊断依据。4.主要研究结果1)恒温扩增-防污染核酸试纸条在快速检测结核分枝杆菌中的应用在465例结核病患者的痰液样本中,22例为操作过程中污染,10例为非结核分枝杆菌感染,为达到方法学间的可比性,本研究去除了污染病例及非结核分枝杆菌病例共计32例。在剩余的433例样本中,涂片抗酸染色、L-J培养、MGIT/960液体培养以及恒温扩增这4种方法的阳性检出率分别为37.4%(162/433)、47.1%(204/433)、51.3%(222/433)以及45.0%(195/433)。本研究中涂片抗酸染色的平均报告时间为4小时,MGIT/960液体培养的平均报告阳性时间为13天,L-J培养的平均报告阳性时间为30天,恒温扩增法自样本收集至最终报告时间为4小时。以MGIT/960液体培养为金标准,三种方法的检测灵敏度分别为涂片抗酸染色70.7%(157/222),L-J培养89.6%(199/222),恒温扩增法83.8%(186/222)；检测特异度分别为涂片抗酸染色97.6%(206/211),L-J培养97.6%(206/211),恒温扩增法95.7%(202/211)；经统计学检验三种方法与金标准相比较P值均小于0.05,有统计学显著差异。涂片抗酸染色、L-J培养及恒温扩增法Kappa一致性检验结果分别为67.9%、87.1%及79.7%。在AFB阴性MGIT/960阳性患者中,L-J培养法的检测灵敏度为70.8%(46/65),恒温扩增法的灵敏度为78.5%(51/65)；L-J培养的检测特异度为98.0%(202/206),恒温扩增法为98.5%(203/206)；经统计学分析二种方法与金标准相比较,P值均小于0.05,有显著性差异。Kappa一致性检验L-J培养为74.7%,恒温扩增法为81.7%。以上研究结果表明该试剂盒不仅对结核分枝杆菌有很好的阳性检出率,特别是对涂片抗酸染色阴性培MGIT/960液体培养阳性的结核病患者有较高的灵敏度及特异度,而且操作简便快速,无需特殊设备仪器,适合于在基层医疗机构开展。2)结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂盒评估本研究我们使用了一种全新的基于双重标记探针溶解曲线分析的RT-PCR方法,此方法针对rpoB 81bp核心区域、katG315、inhA启动子、ahpC启动子和embB306所设计的六种探针来检测临床标本。首先,选取10株突变区域较为广泛的MDR菌株,用单光路RT-PCR对其不同的突变位点进行溶解曲线分析,所有的耐药突变都能通过其溶解曲线与野生型菌株的差异来检测。其次我们选取了158株MDR菌株进行RT-PCR检测,与测序结果相比较,本方法的检测特异度和灵敏度均为100%。本研究提供了耐药结核检测的新技术,相比较其他RT-PCR方法,本方法只需要少量的探针,在双重反应中不同的探针可以使用同一种荧光基团来标记,因此本方法只需使用单通道RT-PCT仪即可。总之,此方法是一种全新的能够被广泛应用的结核分枝杆菌耐药基因突变的检测手段。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
前言  9-13
第一部分恒温扩增-防污染核酸试纸条在快速检测结核分枝杆菌中的应用  13-22
  材料与方法  14-17
  结果  17-19
  讨论  19-22
第二部分结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂盒评估  22-34
  材料与方法  22-27
  结果  27-32
  讨论  32-34
全文总结  34-36
参考文献  36-41
综述  41-54
  参考文献  50-54
硕士期间发表的论文  54-55
致谢  55-56

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