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结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、Ag85B对外周血FoxP3mRNA的诱导作用

作　者: 杜忠仁
导　师: 李克
学　校: 汕头大学
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 结核分枝杆菌 CD4+CD25+调节性T细胞 FoxP3 ESAT-6 Ag85B
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景和目的:结核病是我国重大传染病之一,是严重危害我国人群健康的呼吸道传染病。本课题组前期研究发现,耐药性空洞型肺结核病人经有效手术治疗后,CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)细胞水平明显下降。CD4+CD25+Treg细胞水平上调与结核分枝杆菌感染存在高度相关性,但其产生机制并不清楚。因此我们选取结核菌分泌蛋白ESAT-6和Ag85B对人外周血进行刺激,运用流式细胞术检测外周血中CD4+CD25+Treg细胞(%PBMC),证明经蛋白刺激后CD4+CD25+Treg细胞明显升高。由于CD25在活化的T细胞(包括CD4+ CD25-T细胞)中表达,而叉头样转录因子FoxP3在激活的CD4+CD25-T细胞上并不表达,是CD4+CD25+Treg细胞的特异性生物标志,其表达水平与CD4+CD25+Treg细胞数量成正相关。因CD25作为明确的Treg的生物标志受限,为了更精确的检测Treg水平,应用RT-PCR技术检测FoxP3mRNA表达水平。本论文主要通过检测FoxP3 mRNA表达水平,从基因水平上观察经ESAT-6和Ag85B刺激后的外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞改变,为研究结核分枝杆菌诱导CD4+CD25+ FoxP3+调节性T细胞上调产生免疫逃逸机制提供新的依据。材料和方法:1.对汕头市第三人民院进行结核病流行病学调查,获取痰培养和药敏试验及病人的一般信息,描述当地结核病分布情况。2.从健康人群、潜伏期感染者、耐药性结核病病人中随机选取志愿者,对其空腹静脉取血。3.采用不同浓度(0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml)的ESAT-6、Ag85B、ESAT-6+Ag85B、BCG处理血液,培养24h、48h、72h后,实时荧光定量PCR检测FoxP3 mRNA表达水平。结果:1.结核病流行病学调查发现,痰培养阳性者中男性多于女性,且男性年龄高于女性。而药敏试验中耐药性结核病所占比例偏高。2.不同浓度ESAT-6,Ag85B刺激外周血24h、48h、72h后发现随浓度的增加,FoxP3mRNA有升高趋势,培养24小时FoxP3mRNA表达水平最高,后随时间延长有下降趋势,但均无统计学意义。3.在未经分泌蛋白刺激前,三组(健康对照组、潜伏期感染组、病例组)中FoxP3 mRNA表达水平比较,病例组与潜伏期感染组高于对照组,但病例组和潜伏期感染组间比较差别无统计学意义。4.分泌蛋白处理前后比较,经ESAT-6、Ag85B、ESAT-6+Ag85B处理后FoxP3mRNA水平高于处理前水平(P<0.05),但BCG处理后FoxP3mRNA略有升高,但差别无统计学意义。5.不同蛋白处理后三组间比较发现,潜伏期感染组经抗原刺激后,FoxP3mRNA水平高于病例组和健康对照组。病例组低于对照组,但无统计意义。结论:目前耐药性结核病流行,迫切需要了解结核菌的免疫逃逸机制以寻找治疗办法。经体外抗原刺激外周血培养实验发现,外周血FoxP3 mRNA表达水平与ESAT-6,Ag85B存在剂量-反应关系。ESAT-6、Ag85B作为结核菌的主要分泌蛋白,意味着菌量负荷增加后可诱导FoxP3 mRNA表达水平上调。CD4+CD25+ FoxP3+Treg细胞是结核分枝杆菌逃避机体免疫清除过程中不可或缺的因素,故认为ESAT-6、Ag85B两种抗原可能与结核菌的免疫逃逸有关。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6
缩略词  6-12
第一章前言  12-19
  1.1 机体对结核分枝杆菌的免疫清除机制  12-13
  1.2 CD4+CD25+FoxP3+Treg在结核分枝杆菌免疫逃逸机制中的作用  13-15
  1.3 FoxP3 是CD4+CD25+调节性T细胞的特异性标志物  15-16
  1.4 ESAT-6、A9858对FoxP3+Treg细胞的诱导作用  16-19
第二章材料与方法  19-25
  2.1 实验材料  19-20
    2.1.1 研究对象  19
    2.1.2 实验仪器  19-20
    2.1.3 实验用试剂  20
  2.2 实验方法  20-24
    2.2.1 实验器具的处理与准备  20-21
    2.2.2 试剂配制和准备  21
    2.2.3 剂量设置及血液培养  21
    2.2.4 提取白细胞  21-22
    2.2.5 TRIzol 法抽提总RNA  22
    2.2.6 RT-PCR  22-24
    2.2.7 琼脂糖凝胶电泳  24
  2.3 数据分析  24-25
第三章结果  25-42
  3.1 对汕头市第三人民医院进行结核病流行病学调查  25-28
    3.1.1 痰培养阳性者中，男女间年龄比较  25-26
    3.1.2 不同耐药组间年龄因素比较  26
    3.1.3 药敏试验与年龄间相关关系  26-27
    3.1.4 在不同性别间三种药敏结果进行比较  27
    3.1.5 在5 月-12 月份，三种不同药敏结果在此期间的分布趋势  27-28
  3.2 RNA纯度检测  28
  3.3 RT-PCR结果  28-30
    3.3.1 外周血中FoxP3 和β-actin 的SYBR Green RT-PCR 溶解曲线图及电泳分析结果  28-30
    3.3.2 外周血中FoxP3 和β-actin RT-PCR 扩增曲线  30
  3.4 FoxP3 mRNA关于抗原浓度和培养时间的趋势研究  30-33
    3.4.1 不同组别在不同浓度蛋白处理后的总趋势  30-32
    3.4.2 不同组别在不同浓度蛋白处理后的趋势  32-33
  3.5 同一组别不同蛋白比较，FOXP3 mRNA表达量结果分析  33-35
    3.5.1 同一组别不同处理因素之间进行比较(对照组)  34
    3.5.2 同一组别不同处理因素之间进行比较(病例组)  34-35
    3.5.3 同一组别不同处理因素之间进行比较(潜伏期感染组)  35
  3.6 经同一蛋白处理后，三组间FoxP3 mRNA表达量比较  35-42
    3.6.1 同一处理因素不同组别间比较（未处理组）  35-36
    3.6.2 同一处理因素不同组别间比较（ESAT-6）  36
    3.6.3 同一处理因素不同组别间比较（ESAT-6+A9858）  36-37
    3.6.4 同一处理因素不同组别间比较（A9858）  37
    3.6.5 同一处理因素不同组别间比较（BCG）  37-42
第四章讨论  42-48
  4.1 汕头第三人民医院结核病流行病学调查  42
  4.2 ESAT-6、A9858不同浓度梯度和时间下对FoxP3 mRAN的影响  42-43
  4.3 分泌蛋白对FoxP3 mRAN的影响  43-46
    4.3.1 ESAT-6 对FoxP3 mRAN 的作用  44-45
    4.3.2 A9858 对FoxP3mRAN 的作用  45-46
    4.3.3 ESAT-6 联合A9858 对FoxP3+Treg 的作用  46
  4.4 BCG对FoxP3 m RNA作用  46-48
第五章结论  48-50
  5.1 本研究结论  48
  5.2 本研究创新点  48-49
  5.3 本研究之不足  49
  5.4 展望  49-50
参考文献  50-54
文献综述  54-61
  参考文献  58-61
个人简历  61-62
致谢  62

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、Ag85B对外周血FoxP3mRNA的诱导作用

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