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阔叶猕猴桃高效再生体系的建立及遗传转化的研究

作　者: 毕静华
导　师: 刘永立
学　校: 浙江大学
专　业: 果树学
关键词: 阔叶猕猴桃根癌农杆菌抗生素愈伤组织暗处理外植体激素 GUS PCR 生根不定芽再生蔗糖遗传转化
分类号: S663.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

猕猴桃作为新兴水果,营养丰富,被誉为“水果之王”,以高于其他水果数倍甚至几十倍的维生素C含量而被人们所青睐(黄宏文,2000)。阔叶猕猴桃(Actinidia latifolia)又名多花猕猴桃,生长在云南、广西、湖南、四川和贵州等地,果实可加工食用,适合造果汁和果酒,其鲜果中维生素C含量高达939.8～2140mg/100g,是猕猴桃属中发现的维生素C含量最高的种(崔致学,1993)。阔叶猕猴桃作为珍贵的猕猴桃种质资源,具有广阔的市场前景和开发利用价值。本文以阔叶猕猴桃叶片和叶柄为材料,建立了高效可重复的再生体系,并在此基础上通过根癌农杆菌介导法对阔叶猕猴桃叶柄进行基因转化研究。经过抗生素筛选培养和植株再生,获得了转基因抗性芽,并通过GUS组织化学染色、PCR等技术对转基因材料进行了检测。本文首次研究了阔叶猕猴桃的器官形成和植株再生,并建立了遗传转化体系,为阔叶猕猴桃遗传资源的利用和分子育种提供了技术参数,为通过基因工程有目的的改良猕猴桃某些性状奠定了基础。主要研究结果如下: 1.以阔叶猕猴桃叶片和叶柄为外植体,通过器官发生途径诱导形成不定芽,建立了高效的再生体系。探讨了不同激素组合、暗培养时间以及蔗糖浓度对叶片和叶柄离体再生的影响。结果表明,叶片外植体在I/2MS(Murashige and Skoog,1962)+0.1μM NAA+5μM Zeatin附加20g/L蔗糖的培养基上,进行21d暗处理后转到光下培养效果最好,6周后不定芽再生率达91.7%,平均再生芽数6.9个/外植体。而叶柄外植体在1/2MS+0.1μM NAA+5μM Zeatin附加20g/L蔗糖,进行14d暗处理后转到光下培养效果最好,5周后不定芽再生率达到100%,平均再生芽数18.2个/外植体。同时发现,高浓度的BA不仅抑制不定芽的形成也会导致玻璃化现象的产生;光对不定芽的再生至关重要。再生不定芽生根良好,并被成功驯化后移植大田。 2.以阔叶猕猴桃叶片和叶柄为外植体,探讨了各种抗生素对愈伤组织和不定芽形成以及不定芽生根的影响。结果发现,卡那霉素(Kanamycin,Kan)明显抑制叶片和叶柄的分化。当Kan浓度达到20mg/L时叶片的分化被完全抑制,当达到25mg/L时,叶柄的分化也被完全抑制。在愈伤组织和不定芽诱导过程中,头孢霉素(Ceftomine,Cef)对不定芽分化的效果明显好于羧苄青霉素(Carbenicillin,Carb)。Cef浓度为300mg/L时叶片和叶柄的再生频率最高,均达到100%,叶片平均再生芽数为9.8个/外植体,叶柄平均再生芽数为12.4个/外植体。高浓度的Cef(≥200mg/L)对不定芽生根有明显的抑制作用,无论生根率还是平均根数、根

全文目录

致谢  6-7
缩略语表  7-9
摘要  9-11
绪论  11-17
  1.猕猴桃组织培养  11-13
  2.遗传转化的研究进展  13-15
  3.立题背景及主要研究内容  15-17
第一章阔叶猕猴桃高效再生体系的建立  17-32
  第一节叶片高效再生体系的建立  17-25
    1.1 激素种类和浓度对叶片愈伤组织和不定芽形成的影响  17-20
    1.2 暗处理对叶片愈伤组织和不定芽形成的影响  20-21
    1.3 蔗糖浓度对叶片愈伤组织和不定芽形成的影响  21-23
    1.4 培养基种类对叶片愈伤组织和不定芽形成的影响  23-24
    1.5 外植体种类对愈伤组织和不定芽形成的影响  24-25
  第二节叶柄高效再生体系的建立  25-28
    2.1 激素种类和浓度对叶柄愈伤组织和不定芽形成的影响  25-26
    2.2 暗处理对叶柄愈伤组织和不定芽形成的影响  26-27
    2.3 蔗糖浓度对叶柄愈伤组织和不定芽形成的影响  27-28
  第三节再生不定芽的生根和驯化  28-30
  讨论  30-32
第二章根癌农杆菌介导的阔叶猕猴桃遗传转化研究  32-50
  第一节抗生素对阔叶猕猴桃形态发生和器官形成的影响  32-40
    1.1 Kan对叶片、叶柄愈伤组织和不定芽形成的影响  32-35
    1.2 Cef和Carb对叶片、叶柄愈伤组织和不定芽形成的影响  35-37
    1.3 Cef和Carb对不定芽生根的影响  37-38
    1.4 Kan和Carb组合对不定芽生根的影响  38-39
    讨论  39-40
  第二节根癌农杆菌介导的阔叶猕猴桃叶柄的遗传转化  40-50
    2.1 植物材料和农杆菌的准备  40-42
    2.2 外植体预培养时间对转化效率的影响  42-43
    2.3 农杆菌感染时间对转化效率的影响  43-44
    2.4 农杆菌浓度对转化效率的影响  44-45
    2.5 共培养时间对转化效率的影响  45-46
    2.6 AS添加方式对转化效率的影响  46-47
    2.7 抗性芽的生根培养  47
    2.8 GUS基因组织化学染色  47-48
    讨论  48-50
第三章阔叶猕猴桃转基因材料的检测  50-53
  第一节转基因材料的PCR特异扩增检测  50-52
    1.1 改良SDS法快速提取基因组DNA  50-51
    1.2 PCR检测  51-52
  第二节 GUS基因表达的组织化学分析结果  52
  讨论  52-53
参考文献  53-60
Abstract  60-63
版图  63-66
附录  66-68

阔叶猕猴桃高效再生体系的建立及遗传转化的研究

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