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耐药结核分枝杆菌耐药相关基因分析及快速检测

作　者: 王莹
导　师: 胡昌华；张文宏；谢建平
学　校: 西南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 结核分枝杆菌链霉素耐药乙胺丁醇耐药基因分析焦磷酸测序技术
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

结核病严重威胁人类健康。近年来，由于不规范结核治疗导致的耐药结核分枝杆菌成为结核治疗中的难点。从基因水平阐明结核分枝杆菌耐药性变异的机理，并在此基础上建立敏感、快速和特异的检测方法是当务之急。链霉素和乙胺丁醇是一线抗结核药物，目前研究表明rpsL基因和embB基因的突变分别和结核分枝杆菌链霉素及乙胺丁醇的耐药密切相关。rpsL基因的突变主要集中在43位密码子，embB基因的突变则多发生在306位密码子。不同国家不同地区结核分枝杆菌基因突变的特点有所不同，有必要对我国的突变情况进行研究，分析其突变特点，在此基础上建立的分子生物学快速检测耐药性方法才符合我国实际情况。本研究采用了直接测序的方法对临床耐药结核分枝杆菌菌株的耐药相关基因进行分析，检测了链霉素耐药株的rpsL基因和乙胺丁醇耐药株的embB基因。150株链霉素耐药株中2株rpsL基因缺失，115株rpsL基因存在突变，突变率为77.70％，最主要的突变形式是43位密码子突变，59.46％(88／148)存在此突变。117株乙胺丁醇耐药株中有100株存在embB基因突变，突变率为85.47％，最主要的突变位点是306位密码子，47.86％(56／117)的突变发生于此位点。在以上的工作基础上，设计引物分别扩增含有43位密码子的rpsL基因片断和含有306位密码子的embB基因片断，运用焦磷酸测序技术(Pyroseuencing)对此区域进行序列测

全文目录

1 综述  10-21
  1.1 链霉素耐药机制  11-12
  1.2 乙胺丁醇耐药机制  12-13
  1.3 耐药性的快速检测  13-21
    1.3.1 直接测序法  14
    1.3.2 限制性内切酶片断长度多态性  14-15
    1.3.3 聚合酶链式反应-单链构象多态性  15
    1.3.4 双脱氧指纹图谱分析  15-16
    1.3.5 RNA／RNA错配法  16
    1.3.6 异源双链DNA构象分析法  16-17
    1.3.7 线性探针分析法  17
    1.3.8 基因芯片技术  17-18
    1.3.9 实时PCR方法  18-19
    1.3.10 噬菌体裂解法  19-21
引言  21-22
2 材料与方法  22-30
  2.1 试验材料  22-23
    2.1.1 菌株来源  22
    2.1.2 主要试剂与酶类  22
    2.1.3 DNA合成与序列测定  22
    2.1.4 主要试验仪器  22-23
  2.2 试验方法  23-30
    2.2.1 结核分枝杆菌基因组DNA的抽提  23-24
    2.2.2 rpsL基因的扩增及分析  24-25
    2.2.3 embB基因的扩增及分析  25-26
    2.2.4 Pyrosequencing分析  26-30
3 结果与分析  30-39
  3.1 rpsL基因的扩增和分析  30-33
  3.2 embB基因的扩增和分析  33-36
  3.3 Pyrosequencing分析  36-39
    3.3.1 rpsL基因43位密码子Pyrosequencing分析  36-37
    3.3.2 embB基因306位密码子Pyrosequencing分析  37-39
4 结论与讨论  39-44
  4.1 结核分枝杆菌链霉素耐药与rpsL基因突变  39
  4.2 结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药与embB基因突变  39-40
  4.3 Pyrosequencing测序技术  40-43
  4.4 结论  43-44
参考文献  44-49
致谢  49

耐药结核分枝杆菌耐药相关基因分析及快速检测

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