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对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的检测及其流行情况初步调查

作　者: 杨冰
导　师: 宋微波；黄倢
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) 白斑综合征病毒(WSSV) 对虾 PCR 核酸探针 原位杂交 多重PCR
分类号: S945
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


对虾传染性皮下及造血组织坏死病(Infectious hypodermal & haematopoietic necrosis，IHHN)也称慢性矮小残缺综合症(runt-deformity syndrome，RDS)最初于1981年在美国夏威夷地区养殖细角滨对虾(Litopenaeus stylirostris)中被发现(Lightner et al，1983)，可感染世界各地养殖对虾，危害严重。国际兽疫局(Office international des épizooties，OIE，2003)将该病划为须向其申报的甲壳类其他重要疾病之一。 本研究针对该病病原对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)，建立了组织病理、核酸探针、PCR及IHHNV与对虾白斑综合征病毒(WSSV)的多重PCR检测技术。其中对携带IHHNV的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织病理学检查发现受感染细胞细胞核内典型的Cowdry A(Cowdry type A)型包涵体，为证实这一结论，本研究根据Genbank登录的IHHNV基因序列(AF218266)，设计了一对特异性引物，从纯化的IHHNV DNA和携带IHHNV凡纳滨对虾组织DNA中成功地扩增出产物大小为703bp的DNA片段，该对引物对IHHNV DNA的检测灵敏度为19.85fg(相当于8.83×10~3个病毒拷贝)，与健康对虾组织DNA、WSSV DNA及对虾肝胰腺细小病毒(HPV)DNA均无交叉反应。该方法可快速、灵敏、特异地检测出对虾感染和携带IHHNV状况，为对虾健康养殖、无特定病原(SPF)种群选育及流行病调查提供了有效的检测手段。本研究同时还建立了WSSV PCR技术方法，该方法扩增的目的片段大小为824bp，对WSSV DNA检测灵敏度为520fg，相当于1.54×10~3个病毒拷贝。 在已建立的IHHNV PCR检测方法的基础上利用非放射性标记物地高辛(DIG)制备了DNA探针，通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证，结果表明其对IHHNV DNA的检出灵敏度为24.8pg，可检出26.6ng患病对虾组织DNA中的病毒且与健康虾组织、WSSV DNA、HPV DNA均不发生交叉反应。同时此探针的原位杂交结果也显示出强杂交信号，说明该探针具有较高的灵敏度及特异性。 根据对上述建立的各诊断方法检测结果的综合分析，从而确认了本研究采集的凡纳滨对虾样品受IHHNV感染的结论。IHHNV与WSSV的多重PCR反应体系可同时扩增WSSVDNA和IHHNV DNA，且对健康对虾组织DNA及HPV DNA无任何条带出现。该系统对WSSV DNA的检测灵敏度为2.6pg，相当于7.70×10~3个病毒拷贝；对IHHNV DNA的检测灵敏度为99.25fg，相当于4.38、1少个病毒拷贝。比单一PcR检测灵敏度低10倍。 为消除实验室核酸污染，将中国对虾白斑综合征病毒(WSSV)病毒液分别与万福金安含氧消毒剂、高锰酸钾、甲醛、过氧化氢、甲酚皂、酒精和氯仿作用。不同浓度消毒剂与病毒液作用不同时间后提取DNA作病毒核酸斑点杂交检测。经分析比较表明，上述消毒剂中含氯消毒剂在有效氯含量高于2.975、10一、高锰酸钾浓度高于5.000、10一3 smin内;有效纵含量高于1.290、一。一3、高锰酸钾浓度在so00xlo一30min即可破坏核酸。 应用PCR检测技术对2001一2004年我国沿海部分养殖地区对虾及其饵料和环境生物携带IHI硕NV及WSSV情况进行了调查，调查结果显示，在281份被检对虾样品包括凡纳滨对虾、细角滨对虾(L itOPenaeuss如lirostris)、中国明对虾(Fe nnerorenaeusc人inensis)和日本囊对虾(MarsuPenaeus joponicus))中，IHHNV携带的对虾品种均为凡纳滨对虾，阳性率达54.8%，幼虾(Juvenile)和仔虾(postlarvae)样品携带IHHNv的阳性比率较高:饵料和环境生物卤虫(翻emia)、沙蚕困ereidae)、轮虫(Rotatoria)、挠足类(Copepoda)、绒鳌近方蟹(价m正graPsus peniCillatus))的检测结果显示绒鳌近方蟹样品呈IHHNv阳性;日本对虾、凡纳滨对虾和绒鳌近方蟹中均可检出WSSV，阳性率为40.9%，幼虾和成虾携带WSSV的阳性比率较高;在采集的对虾样品中，同时感染WSSV和IHHNV的凡纳滨对虾样品阳性率达29.5%，其中幼虾同时携带WSSV和IHHNV的比率最高。环境生物中的蟹类也可同时携带两种病毒，该结果在国内未见相关报道。 本研究结果首次发现在自然状态下养殖凡纳滨对虾和蟹类可同时携带IHHNV和WSsV两种病毒。证实我国养殖凡纳滨对虾确实携带有IHHNV，在自然状态下该病毒能否在我国其它养殖对虾品种和环境生物中传播并流行，及其在我国的分布情况和造成的危害需进一步跟踪、调查。关键词:传染性皮下及造血组织坏死病毒aHHNv)、白斑综合征病毒(wssV)、对虾、PcR、核酸探针、原位杂交、多重PCR

全文目录


对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的检测及其流行情况初步调查  2-12
第一章 综述  12-30
  1 对虾病毒性疾病研究进展  12-16
    1.1 引言  12
    1.2 对虾主要病毒性疾病病原特性  12-15
    1.3 对虾主要病毒性疾病的诊断  15-16
  2 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)研究概况  16-25
    2.1 引言  16-17
    2.2 IHHNV的病毒特性及分类地位  17
    2.3 IHHNV感染宿主及传播途径  17-18
    2.4 IHHNV地理分布及其致病性  18-19
    2.5 疾病的诊断方法  19-20
    2.6 常规诊断技术  20-22
      2.6.1 临床症状  20-21
      2.6.2 组织学方法  21-22
      2.6.3 其它常规诊断技术  22
    2.7 分子生物学诊断技术  22-23
    2.8 疾病防治  23-25
      2.8.1 SPF对虾苗种选育  23
      2.8.2 对虾防病养殖技术模式  23
      2.8.3 我国对虾苗种繁育和健康养殖中存在的问题与对策  23-25
  参考文献  25-30
第二章 对虾传染性皮下及造血组织坏死病(IHHN)病理学观察  30-34
  1 材料与方法  30-32
    1.1 材料  30
      1.1.1 实验用对虾样品  30
      1.1.2 试剂和材料  30
    1.2 方法  30-32
      1.2.1 石蜡切片的制备  30-31
      1.2.2 电镜切片的制备  31-32
  2 结果  32-33
    2.1 组织病理观察  32-33
    2.2 细胞病理观察  33
  3 讨论  33-34
第三章 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)和白斑综合征病毒(WSSV)PCR检测技术的建立及病毒流行情况初步调查  34-61
  第一节 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)PCR检测方法的建立  34-40
    1 材料与方法  34-36
      1.1 材料  34-35
        1.1.1 对虾及病毒样品  34
        1.1.2 试剂和材料  34-35
      1.2 方法  35-36
        1.2.1 DNA的提取  35
        1.2.2 PCR反应条件优化  35
        1.2.3 PCR反应特异性和灵敏度  35
        1.2.4 电泳  35-36
    2 结果  36-38
      2.1 优化的PCR反应  36-37
      2.2 PCR反应特异性和灵敏度  37-38
    3 讨论  38-40
  第二节 对虾白斑综合征病毒(WSSV)PCR技术  40-45
    1 材料与方法  40-41
      1.1 材料  40-41
        1.1.1 对虾及病毒样品  40
        1.1.2 试剂和材料  40-41
      1.2 方法  41
        1.2.1 DNA的提取  41
        1.2.2 PCR反应条件优化  41
        1.2.3 PCR反应特异性和灵敏度  41
        1.2.4 电泳  41
    2 结果  41-44
      2.1 优化的PCR反应  41-43
      2.2 PCR反应灵敏度分析  43-44
    3 讨论  44-45
  第三节 消毒剂对对虾白斑综合征病毒(WSSV)DNA作用效果的比较  45-49
    1 材料与方法  45-46
      1.1 材料  45
        1.1.1 对虾及消毒剂样品  45
      1.2 方法  45-46
        1.2.1 病毒液的准备  45
        1.2.2 消毒剂和病毒液的作用  45-46
        1.2.3 斑点杂交检测  46
        1.2.4 有效氯含量的测定  46
    2 结果  46-47
    3 讨论  47-49
  第四节 对虾及其饵料和环境生物样品携带WSSV及IHHNV情况调查  49-56
    1 材料与方法  49-50
      1.1 材料来源  49-50
      1.2 样品的准备  50
      1.3 DNA提取  50
      1.4 PCR反应  50
      1.5 电泳  50
    2 结果  50-53
      2.1 不同月份采集的我国沿海部分地区养殖对虾样品携带WSSV和IHHNV状况比较  50-51
      2.2 不同品种及生长阶段的养殖对虾样品携带WSSV和IHHNV状况比较  51-52
      2.3 对虾饵料和环境生物中携带WSSV和IHHNV的情况  52-53
    3 讨论  53-56
      3.1 IHHNV的流行情况  53-54
      3.2 WSSV的流行情况  54
      3.3 WSSV与IHHNV的流行相关性  54-56
  第五节 多重PCR检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)及传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)  56-61
    1 材料与方法  56-58
      1.1 材料  56-57
        1.1.1 对虾及病毒样品  56
        1.1.2 试剂和材料  56-57
      1.2 方法  57-58
        1.2.1 DNA的提取  57
        1.2.2 多重PCR反应条件优化  57
        1.2.3 多重PCR反应特异性和灵敏度  57
        1.2.4 电泳  57-58
    2 结果  58-59
      2.1 优化的多重PCR反应条件  58-59
      2.2 多重PCR反应灵敏度分析  59
    3 讨论  59-61
第四章 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)核酸探针检测技术的建立  61-70
  第一节 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)核酸探针斑点杂交  61-66
    1 材料与方法  61-63
      1.1 材料  61-62
        1.1.1 对虾样品  61-62
      1.2 方法  62-63
        1.2.1 DNA的提取  62
        1.2.2 IHHNV感染样品  62
        1.2.3 PCR法制备地高辛(DIG)标记DNA探针  62
        1.2.4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析  62-63
        1.2.5 地高辛(DIG)标记DNA探针产量的测定  63
    2 结果  63-65
      2.1 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳分析  63-64
      2.2 PCR制备地高辛(DIG)标记DNA探针产量测定结果  64
      2.3 地高辛(DIG)标记IHHNV DNA探针斑点杂交检测各样品  64-65
    3 讨论  65-66
  第二节 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)原位杂交  66-70
    1 材料与方法  66-68
      1.1 材料  66
        1.1.1 实验用对虾样品  66
        1.1.2 试剂和材料  66
      1.2 方法  66-68
        1.2.1 组织切片的准备  66-67
        1.2.2 原位杂交  67-68
    2 结果  68-69
      2.1 原位杂交结果观察  68-69
    3 讨论  69-70
小结  70-71
参考文献  71-75
附录  75-86
致谢  86

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治
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