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壳聚糖酶产生菌的鉴定及其发酵条件、酶学性质研究

作　者: 冯俊丽
导　师: 朱旭芬
学　校: 浙江大学
专　业: 遗传学
关键词: 壳聚糖壳聚糖酶 16SrDNA 发酵条件 SDS-PAGE 薄层层析基因克隆
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

从自然界筛选到一批几丁质／壳聚糖酶产生菌株，利用16S rRNA序列分析对其进行初步的鉴定。结合形态特征和生理生化性质，将一株高产壳聚糖酶菌株C-28归为细菌域、变形杆菌门、β-变形杆菌纲、伯克霍尔德氏菌目、伯克霍尔德氏科。研究确定C-28最佳产酶发酵条件为：培养温度33℃、壳聚糖浓度2％、接种量2％、pH6、装量300ml。在此培养条件下，48h时摇瓶中发酵液的最高酶活力可达3.81 U／mL，是迄今所见报道中最高的发酵液酶活力水平。通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-200凝胶柱层析，纯化了C-28壳聚糖酶，该酶的分子量为34.9kD，最适反应pH值为7.0，最适反应温度为46℃，在45℃以下、pH 5.0—8.0的环境中比较稳定，Mn²⁺、Mg²⁺、Na⁺、K⁺对该酶的酶活力有促进作用，而Cu²⁺、Co²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺对它具有抑制作用。薄层层析对酶解产物分析表明该壳聚糖酶对底物的作用方式是内切型。此外，还对CJ-5菌株产生的几丁质酶与壳聚糖酶进行了纯化及理化性质的研究。

全文目录

中文摘要  5-6
英文摘要  6-7
前言  7-13
材料与方法  13-25
  1 实验菌株  13
  2 培养基  13-14
  3 试剂  14-16
  4 仪器设备  16
  5 几丁质／壳聚糖酶产生菌株的复选  16
  6 几丁质／壳聚糖酶产生菌株的部分16S rDNA序列的测定  16-17
    6.1 模板DNA的提取  16
    6.2 引物的合成  16-17
    6.3 16S rDNA PCR扩增反应条件的优化  17
    6.4 产物的序列测定与结果分析  17
  7 壳聚糖酶产生菌C-28的形态特征与理化特性鉴定  17
    7.1 形态特征鉴定  17
    7.2 生理生化特性鉴定  17
  8 摇瓶中C-28发酵液酶活力的测定与发酵条件的优化  17-20
    8.1 发酵液酶活力的测定  17-19
    8.2 发酵条件的优化  19-20
    8.3 四因素三水平正交实验  20
    8.4 C-28在最适产酶条件下，发酵液中pH、还原糖和酶活变化  20
  9 C-28壳聚糖酶理化性质的初步研究  20-23
    9.1 C-28壳聚糖酶的初步纯化  20-21
    9.2 C-28壳聚糖酶反应的最适温度和酶的热稳定性  21-22
    9.3 C-28壳聚糖酶反应的最适pH和酶的酸碱稳定性  22
    9.4 C-28壳聚糖酶的底物特异性  22
    9.5 金属离子对C-28壳聚糖酶活力的影响  22
    9.6 C-28壳聚糖酶分子量的测定  22-23
  10 C-28壳聚糖酶降解产物的初步分析  23
  11 C-28壳聚糖酶基因的克隆  23
    11.1 模板DNA的提取及检测  23
    11.2 壳聚糖酶基因引物的设计  23
    11.3 PCR扩增C-28壳聚糖酶基因的程序  23
  12 CJ-5几丁质酶、壳聚糖酶的分离纯化  23-25
    12.1 CJ-5几丁质酶、壳聚糖酶的(NH_4)_2SO_4盐析  23-24
    12.2 CJ-5几丁质酶、壳聚糖酶的凝胶柱层析  24
    12.3 CJ-5几丁质酶、壳聚糖酶分子量的测定  24-25
结果  25-43
  1 几丁质酶、壳聚糖酶产生菌株的复选  25
  2 几丁质酶、壳聚糖酶产生菌株的部分16S rDNA序列  25-30
    2.1 PCR反应条件与反应体系  25
    2.2 PCR扩增产物序列测定及分析  25-30
  3 壳聚糖酶产生菌C-28菌株的分类鉴定  30-32
    3.1 C-28菌株部分16S rDNA序列分析  31
    3.2 C-28菌株形态特征鉴定  31
    3.3 C-28菌株生理生化特性鉴定  31-32
  4 发酵液酶活力的测定  32-33
    4.1 制作氨基葡萄糖标准曲线  32
    4.2 测定壳聚糖酶活力  32-33
  5 摇瓶中C-28产壳聚糖酶发酵条件的优化  33-36
    5.1 C-28菌株产壳聚糖酶的诱导性  33
    5.2 C-28产壳聚糖酶的分泌性  33
    5.3 摇瓶装量对C-28产酶的影响  33-34
    5.4 培养温度对C-28产酶的影响  34
    5.5 培养基中壳聚糖量对C-28产酶的影响  34-35
    5.6 C-28产壳聚糖酶发酵条件的正交试验  35-36
    5.7 C-28在最适产酶条件下，发酵液中pH，还原糖和酶活变化  36
  6 C-28壳聚糖酶理化性质的初步研究  36-41
    6.1 C-28壳聚糖酶的初步纯化  36-37
    6.2 C-28壳聚糖酶反应的最适温度和酶的热稳定性  37-38
    6.3 C-28壳聚糖酶反应的最适pH和酸碱稳定性  38-39
    6.4 C-28壳聚糖酶的底物特异性  39
    6.5 金属离子对C-28壳聚糖酶活力的影响  39
    6.6 C-28壳聚糖酶的SDS-PAGE  39-40
    6.7 C-28壳聚糖酶分子量的测定  40-41
    6.8 C-28壳聚糖酶酶产物分析  41
  7 CJ-5几丁质酶、壳聚糖酶的分离纯化  41-43
    7.1 柱层析初步纯化壳聚糖酶蛋白  41-42
    7.2 CJ-5几丁质酶、壳聚糖酶的SDS-PAGE和分子量测定  42-43
讨论  43-51
  1 几丁质、壳聚糖酶产生菌株的分类鉴定  43-44
  2 C-28壳聚糖酶活力的测定方法  44-45
  3 C-28产壳聚糖酶发酵条件的研究  45-46
  4 C-28壳聚糖酶的分离纯化  46-47
  5 C-28壳聚糖酶性质研究  47-48
  6 C-28壳聚糖酶酶解产物及作用机理分析  48-49
  7 C-28壳聚糖酶基因的克隆  49
  8 CJ-5几丁质酶和壳聚糖酶的研究  49-51
参考文献  51-56
论文发表  56-57
致谢  57

壳聚糖酶产生菌的鉴定及其发酵条件、酶学性质研究

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