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壳聚糖及其衍生物脱除牡蛎中麻痹性贝类毒素的研究

作　者: 刘晓丽
导　师: 杨锡洪
学　校: 广东海洋大学
专　业: 食品科学
关键词: 近江牡蛎麻痹性贝类毒素壳聚糖羧甲基壳聚糖壳聚糖微球
分类号: TS254.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

近江牡蛎(Ostrea Rivularis Could)是我国沿海主要的贝类养殖品种。麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Poisoning, PSP)广泛影响公共健康和安全,在世界范围内引起了严重的经济损失,它的主要来源是能够产生毒素的亚历山大藻类,然后通过食物链的关系传递给贝类和人类,从而影响人类健康,在很多地区,包括中国都有发现。壳聚糖(Chitosan)及其衍生物(derivatives)是一些高分子化合物,高分子链中含有-NH2和-OH活性基团,能与重金属离子等形成配位化合物,可做为吸附剂,用来脱除重金属等,而且无毒、不产生二次污染,并能被微生物作用分解。本文通过从微小亚历山大藻中提取出PSP,并用壳聚糖及其衍生物(CTSD)对其进行吸附研究;通过对毒素在牡蛎体内蓄积模型的建立,将CTSD应用到牡蛎体内PSP的脱除研究中。具体可以得到以下结论:(1)在实验室对微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)和链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)进行了培养,并对它们的生长条件进行了优化,筛选出了微小亚历山大藻作为产麻痹性贝类毒素的最终来源藻。首先通过接种对数生长期藻细胞,培养8天内就能达到最高细胞密度(2.0×10~4 cells/mL)左右,再以0.05mol/L的乙酸超声波破碎藻细胞提取粗毒素,结合小白鼠生物检测法,经高效液相色谱分析,本株藻主要含有GTX1、GTX2、GTX3和GTX4,浓度分别为GTX4 (5.04)>GTX3(4.97)>GTX1(2.14)>GTX2(2.08)(单位:fmol/cell),毒素粗提液经过Sephadex-G15凝胶层析柱处理,用小白鼠生物法和荧光分光光度法联合检测定位,收集到纯度较高的PSP,本章工作为将来贝类毒素的研究提供原料。(2)用CTSD吸附PSP,在单因素如pH值、反应时间、温度和CTSD添加量的基础上,研究了吸附动力学,通过将动力学数据用动力学一级反应方程和动力学二级反应方程模型来拟合,结果证明更符合动力学二级反应方程模型,说明化学吸附过程是受速度限制的过程。将热力学数据用热力学模型拟合后,发现与Freundlich热力学模型能够很好的符合,并且通过Van’t Hoff方程,得到了吉布斯自由能(△Go)、焓变(△H~o)和熵变(△S~o)。它们的值△G~o<0、△H~o>0、△S~o>0说明反应过程是自发的和吸热的过程。(3)采用实验室培养的方法,研究了在投喂有毒微小亚历山大藻的情况下,微小亚历山大藻所产PSP在近江牡蛎体内蓄积、排出的规律。实验分为蓄积和排出两个部分,蓄积实验设计了三个投喂浓度:A组为4.0×10~3 cell/mL、B组为8.0×10~3cell/mL、C组为1.2×10~4cell/mL,实验结果表明,随着微小亚历山大藻密度的提高,PSP在近江牡蛎体内的蓄积速度会越来越快。A组、B组、C组的最高蓄积量依次为5692 MU、6503 MU和8193 MU,最终蓄积量分别超过了国家限量标准的14.23、16.26、20.48倍。(4)在以上研究的基础上,对B组的牡蛎采用活体排毒素研究,研究发现在养殖过程中投放0.05 g/L的壳聚糖或衍生物和无毒的小球藻,对促进牡蛎体内毒素的排出有较大作用,初始PSP含量为6503 MU的牡蛎,经过15天的脱除后,PSP含量下降到93.33 MU。通过采用死体脱毒的方法,使用本研究制备的壳聚糖微球(用乙酸溶解后,再用戊二醛和甲醛交联)对其进行脱除,研究发现壳聚糖微球对毒素有很好的脱除效果。而且采用壳聚糖微球对牡蛎肉浆中的毒素进行脱除时,牡蛎肉浆不需调pH值即可达到很好的脱除效果,对牡蛎肉浆中毒素的脱除率可达90%以上。(5)对脱毒后的牡蛎肉进行了深加工,为了得到风味良好的牡蛎酶解液,将新鲜的近江牡蛎肉经木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解,采用固相微萃取-气相色谱-质谱(SPME-GC-MS)联用法分析、鉴定了牡蛎肉原料和酶解液的挥发性风味成分,探讨了酶解对牡蛎风味的影响。经NIST质谱数据库检索和文献对照,三个样品分别检出57、60和62种成分,主要有烃类、醇类、醛类、酮类和含硫化合物等,它们的协同作用构成了牡蛎及其酶解液的特征气味。其中牡蛎肉含有较多的酮类化合物,而酶解后则含有较多的醛类和脂类化合物,三个样品中均检出了较多的醇类化合物,归一化含量分别高达40.24%、41.20%和43.28%,中性蛋白酶制备的酶解液比木瓜蛋白酶制备的酶解液风味更加柔和。结果表明,酶解反应能够保持并改善牡蛎的风味,所制备的酶解液具有较好的应用前景。

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摘要 6-8Abstract 8-141 前言 14-22 1.1 麻痹性贝类毒素的研究概况 14-18 1.1.1 麻痹性贝类毒素的来源和分布 14-15 1.1.2 麻痹性贝类毒素的分类及性质 15-16 1.1.3 麻痹性贝类毒素检测分析方法 16-18 1.2 牡蛎简介 18-19 1.3 贝类体内麻痹性贝类毒素的污染状况 19 1.4 麻痹性贝类毒素在贝体内的蓄积及排出 19-20 1.5 贝体内麻痹性贝类毒素的脱除现状 20 1.6 壳聚糖及其衍生物的应用研究概况 20-21 1.7 研究的目的、意义和内容 21-22 1.7.1 研究的目的和意义 21 1.7.2 研究的内容 21-222 赤潮藻的培养 22-28 2.1 实验材料与方法 22-24 2.1.1 主要试剂 22 2.1.2 主要仪器 22 2.1.3 供试藻种 22 2.1.4 实验方法 22-24 2.2 结果与分析 24-27 2.3 本章小结与讨论 27-283 麻痹性贝类毒素的提取、检测及纯化 28-37 3.1 实验材料与方法 28-31 3.1.1 主要试剂 28-29 3.1.2 主要仪器 29 3.1.3 实验方法 29-31 3.2 结果与分析 31-35 3.2.1 微小亚历山大藻和链状亚历山大藻中毒素分析结果 31-34 3.2.2 凝胶色谱中麻痹性贝类毒素的荧光检测 34-35 3.2.3 麻痹性贝类毒素的浓缩 35 3.3 本章小结与讨论 35-374 壳聚糖及其衍生物对水溶液中麻痹性贝类毒素的吸附性研究 37-59 4.1 实验材料与方法 37-38 4.1.1 主要试剂 37 4.1.2 主要仪器 37-38 4.2 实验方法 38-40 4.2.1 麻痹性贝类毒素标准曲线的绘制 38 4.2.2 壳聚糖微球的制备 38 4.2.3 吸附率和吸附量的测定及计算方法 38-39 4.2.4 壳聚糖及其衍生物对水溶液中麻痹性贝类毒素的单因素吸附研究 39 4.2.5 壳聚糖及其衍生物对水溶液中麻痹性贝类毒素的吸附热力学和动力学研究 39-40 4.3 结果与分析 40-57 4.3.1 麻痹性贝类毒素标准曲线 40-41 4.3.2 壳聚糖及其衍生物对水溶液中麻痹性贝类毒素的单因素吸附研究 41-43 4.3.4 壳聚糖及其衍生物对水溶液中麻痹性贝类毒素的吸附热力学和动力学研究 43-57 4.4 本章小结与讨论 57-595 麻痹性贝类毒素在近江牡蛎体内的蓄积及脱除的研究 59-69 5.1 实验材料与方法 59 5.1.1 实验原料 59 5.1.2 主要试剂 59 5.1.3 主要仪器 59 5.2 实验方法 59-62 5.2.1 牡蛎体内毒素本底含量的检测 59-60 5.2.2 麻痹性贝类毒素蓄积实验 60 5.2.3 麻痹性贝类毒素脱除实验 60-62 5.2.4 牡蛎清滤率测算方法 62 5.2.5 样品的处理 62 5.3 结果与分析 62-67 5.3.1 牡蛎体内毒素本底含量的检测结果 62 5.3.2 蓄积实验结果 62-64 5.3.3 壳聚糖微球对牡蛎肉中麻痹性贝类毒素的脱除结果 64-66 5.3.4 牡蛎活体中麻痹性贝类毒素的排除研究 66-67 5.4 本章小结与讨论 67-696 脱毒后牡蛎肉的应用 69-77 6.1 实验材料 69-70 6.1.1 主要试剂 69 6.1.2 主要仪器 69 6.1.3 样品制备方法 69-70 6.1.4 挥发性成分的捕集 70 6.1.5 挥发性成分的分析鉴定 70 6.2 结果与分析 70-76 6.2.1 SPME-GC-MS 总离子流色谱图 70-76 6.3 结论 76-777 总结论与研究展望 77-80 7.1 总结论 77-78 7.2 创新点 78 7.3 研究展望 78-80参考文献 80-90致谢 90-91个人简介 91-92硕士期间发表的论文 92-93导师简介 93

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