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小鲵科线粒体基因的序列分析及其分子系统学研究

作　者: 李悦
导　师: 吴敏；方盛国
学　校: 浙江大学
专　业: 遗传学
关键词: 小鱿科 PCR 16S核糖体RNA 细胞色素b 分子系统学
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

有尾两栖类是现存最低等的陆生脊椎动物，是地球上由水生转向陆生较原始的现存动物。它对研究生物的进化有着重要科研价值。小鲵科是有尾目中最原始的一个类群，在有尾类研究中处于重要地位。本文根据两栖类动物线粒体两端的特征序列确定编码区所在位置，设计特异性引物采用PCR技术从小鲵科基因组DNA中扩增出线粒体基因细胞色素b和16S rRNA部分编码序列，扩增产物经过1.0％的琼脂糖凝胶EB电泳、纯化、回收后转化，再应用抗生素筛选法随机挑取阳性克隆进行PCR检测。鉴定阳性克隆后对重组质粒进行测序。测序结果采用DNASTAR软件包(DNASTAR Inc，1996)中的MegAlign程序对同源序列进行排列，并经人工仔细核查。在此基础上，序列输入MEGA2.1软件包中计算不同序列间的变异位点、简约信息位点数、颠换百分比、转换／颠换比率和两两序列的遗传距离；用MEGA2.1软件基于Kimura 2-parameter距离采用邻近法(Neighbor-Joining)构建分子系统树，同时也用PHYLIP3.6软件包(Felsenstein，2001)使用Heuristic功能搜寻最大简约法(Maximum Parsimony)和最大拟然法(Maximum Likehood)的系统重建。实验结果显示线粒体基因细胞色素b和16S rRNA基因PCR扩增片段在琼脂糖凝胶电泳结果中显示出清晰的特异性扩增条带，经连接及转化实验，在LB固体培养基上长出较多阳性克隆。随机挑菌进行PCR检测，其结果皆为阳性克隆。说明成功克隆出新疆北鲵和秦巴北鲵的线粒体基因细胞色素b和16S rRNA部分编码序列，并将其重组入原核表达载体。对重组质粒进行测序的结果经DNASTAR、MEGA2.1、PHYLIP3.6软件包的不同方法(Neighbor-Joining、Maximum Parsimony、Maximum Likehood)构建出的分子系统树基本相同。结果表明山溪鲵、无斑山溪鲵、北方山溪鲵是三个有效种；巴鲵是有效属且与秦巴北鲵的亲缘关系比较近；黄斑拟小鲵不是秦巴北鲵的同物异名。本实验结果为深入开展小鲵科的分子系统学研究奠定了分子水平上的基础。

全文目录

中文摘要  6-7
Abstract  7-8
第一部分文献综述  8-24
  前言  8-9
  1 、小鲵科各属介绍:  9-15
    1.1 各属特征、分布及生物学:  9-13
      1.1.1 山溪鲵属(Batrachuperus)  9
      1.1.2 小鲵属(Hynobius)  9-10
      1.1.3 巴鲵属(Liua)  10
      1.1.4 爪鲵属(Onychodactylus)  10-11
      1.1.5 肥鲵属(Pachyhyuabius)  11
      1.1.6 北鲵属(Ranodon)  11-12
      1.1.7 极北鲵属(Salamandrella)  12
      1.1.8 拟小鲵属(Pseudohynobiu)  12-13
    1.2 种属分类中存在的问题:  13-15
      1.2.1 山溪鲵的分类  13
      1.2.2 小鲵属的分类  13
      1.2.3 巴鲵属的分类  13-14
      1.2.4 肥鲵属的分类  14
      1.2.5 北鲵属的分类及拟小鲵属的存在  14-15
  2 、小鲵科的重要性:  15-16
    2.1 进化意义  15
    2.2 化石证据  15-16
    2.3 小鲵科的濒危等级  16
  3 、进化分类  16-24
    3.1 生物分类观念与方法的演变  16-17
    3.2 分子生物技术应用于动物分类学之兴起  17-18
    3.3 与分子生物系统分类资料分析有关的计算机软件  18-19
    3.4 小鲵科分类学阐述  19-24
      3.4.1 形态学  19-20
      3.4.2 细胞水平  20-23
        3.4.2.1 染色体研究  20-22
        3.4.2.2 蛋白产物研究  22-23
      3.4.3 分子水平  23-24
第二部分小鲵科线粒体基因序列分析及其分子系统学研究  24-43
  前言  24-25
  1 实验试剂和器材  25-26
    1.1 菌种和质粒  25
    1.2 酶  25
    1.3 试剂盒  25
    1.4 试剂  25
    1.5 器材  25-26
  2 实验材料和方法  26-32
    2.1 材料  26
    2.2 方法  26-32
      2.2.1 小鲵基因组DNA的提取  26-27
      2.2.2 小鲵线粒体部分编码区引物设计及PCR扩增  27
      2.2.3 PCR产物的纯化  27-28
      2.2.4 连接  28
      2.2.5 用CaCl_2转化法将重组质粒DNA导入细菌细胞  28-29
        2.2.5.1 感受态细胞(BL21)的制备  28-29
        2.2.5.2 转化  29
      2.2.6 蓝白斑筛选  29-30
      2.2.7 重组质粒的鉴定  30
      2.2.8 序列测定  30
      2.2.9 序列分析及系统重建  30-32
  3 实验结果  32-40
    3.1 小鲵科基因组DNA提取  32
      3.1.1 DNA纯度检测  32
      3.1.2 基因组DNA电泳检测  32
    3.2 小鲵科线粒体16S rRNA和Cytb基因PCR产物电泳  32-33
    3.3 数据处理  33-38
      3.3.1 基因序列测序结果  33
      3.3.2 线粒体基因序列及其变异  33-38
    3.4 系统进化树  38-40
  4 实验讨论  40-42
    4.1 山溪鲵属有效种的讨论  40
    4.2 巴鲵、秦巴北鲵的分类地位讨论  40-41
    4.3 黄斑拟小鲵的分类地位  41
    4.4 小鲵科系统进化关系  41-42
  5 结论  42-43
参考文献  43-48
致谢  48

小鲵科线粒体基因的序列分析及其分子系统学研究

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