学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

AFP、CBF2基因表达载体的构建及其对苜蓿遗传转化的研究

作　者: 郝凤
导　师: 刘晓静
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 草业科学
关键词: AFP基因 CBF2基因 克隆 载体构建 遗传转化 苜蓿
分类号: S541.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 101次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


低温是限制植物分布与生长的重要因素,低温伤害是一种严重的自然灾害,全球每年因此造成农作物的损失高达数千亿美元。苜蓿(Medicago sativa)为暖温带重要的牧草,对温度反应敏感。低温是制约其生长的主要限制因子,如何提高苜蓿的抗寒性对提高其生产力有重要的意义,利用现代生物学技术进行植物抗冻性分子改良具有高效性和针对性。本研究成功地从胡萝卜和拟南芥中克隆了抗冻蛋白基因AFP和抗冻基因CBF2,并分别构建了植物表达载体并将其导入农杆菌中;还针对目前农杆菌介导转化法中存在的转化率低的问题,对苜蓿的遗传转化体系进行了优化;已通过农杆菌介导转化法,将构建好的AFP、CBF2抗冻基因植物表达载体分别转化到了优良苜蓿品种中。本研究主要成果如下:1.分别以胡萝卜和拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR方法,成功地克隆了全长1200bp的抗冻蛋白基因AFP和全长700bp的抗冻基因CBF2,转化大肠杆菌DH5α,采用IPTG诱导,使宿主菌重组子表达特异的抗冻基因。2.通过双酶切,将其分别连接到PBI121工程质粒上,成功地构建了含有卡那霉素抗性选择标记的植物表达载体P-T-AFP和P-T-CBF2,并通过直接转化法将其导入农杆菌EHA105中。3.遗传转化体系的建立。以培养7天的和田苜蓿的无菌苗子叶为外植体,以农杆菌菌株为介体,预培养3天,侵染时间为10min,菌液浓度OD600=0.3,共培养3天,Kan筛选浓度定为60mg/L,脱菌过程中使用400 mg/L的羧苄青霉素。4.通过叶盘法转化紫花苜蓿,分别将抗冻基因AFP和CBF2导入苜蓿基因组中,经Kan筛选及PCR检测,初步证明抗冻基因AFP和CBF2已整合入苜蓿基因组中。

全文目录


主要英文缩略词表  2-3
摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章 文献综述  8-24
  1 抗冻蛋白基因AFP  8-13
    1.1 抗冻蛋白基因AFP 分离纯化的发展史  8-9
    1.2 抗冻蛋白的功能特性  9-10
      1.2.1 抗冻蛋白非依数性降低冰点的活性  9-10
      1.2.2 抗冻蛋白修饰冰晶形态的活性  10
      1.2.3 抗冻蛋白抑制冰晶发生重结晶  10
    1.3 抗冻蛋白的作用机制  10-11
    1.4 抗冻蛋白基因对植物的遗传转化  11-13
      1.4.1 鱼类抗冻蛋白基因转化植物  11-12
      1.4.2 昆虫抗冻蛋白基因转化植物  12
      1.4.3 植物抗冻蛋白基因转化植物  12-13
  2 抗冻基因CBF  13-17
    2.1 CBF 基因家族的发现及其结构特点  13-14
    2.2 CBF 转录因子的表达  14-15
    2.3 CBF 转录因子的生理生化功能  15-16
    2.4 CBF 转录因子在植物基因工程中的应用  16-17
  3 苜蓿基因工程  17-23
    3.1 常用的基因转化方法  18-20
      3.1.1 农杆菌介导转化法  18
      3.1.2 基因枪转化法  18
      3.1.3 PEG 介导基因转化法  18
      3.1.4 硅碳纤维介导基因转化法  18-19
      3.1.5 电穿孔法  19
      3.1.6 显微注射法  19
      3.1.7 花粉管通道法  19
      3.1.8 超声波转化法  19-20
      3.1.9 脂质体介导法  20
    3.2 转基因苜蓿的研究进展  20-22
      3.2.1 转基因抗寒苜蓿  20-21
      3.2.2 转基因耐盐苜蓿  21
      3.2.3 转基因抗病虫害苜蓿  21-22
    3.3 苜蓿遗传转化存在的问题  22
    3.4 转基因苜蓿的发展局势和应用前景  22-23
  4 研究目的及意义  23-24
第二章 AFP、CBF2 基因植物表达载体的构建及其对农杆菌的直接转化  24-46
  1 试验材料  24
    1.1 植物材料  24
    1.2 菌种和质粒  24
    1.3 常用酶和生化试剂  24
    1.4 主要仪器设备  24
  2 基本培养基  24-25
  3 溶液配制  25-26
  4 引物设计和技术路线  26-29
    4.1 引物设计  26-27
    4.2 植物表达载体构建的技术路线  27-29
  5 试验方法  29-37
    5.1 植物材料的获得  29
      5.1.1 胡萝卜无菌苗的获得  29
      5.1.2 拟南芥无菌苗的获得  29
    5.2 AFP、CBF2 抗冻基因的克隆  29-34
      5.2.1 基因组DNA 的提取  29
      5.2.2 目的片段的获得  29-30
      5.2.3 目的片段的回收  30-31
      5.2.4 目的片段与载体连接  31
      5.2.5 大肠杆菌DH5a 感受态细胞的制备与转化  31-32
      5.2.6 重组质粒的鉴定  32-34
      5.2.7 目的基因的序列测定  34
    5.3 抗冻基因AFP、CBF2 表达载体的构建  34-36
      5.3.1 PBI121 质粒的酶切（一）  34
      5.3.2 PBI121 质粒的酶切（二）  34-35
      5.3.3 T-AFP 与PBI121 酶切产物的连接  35
      5.3.4 T-CBF2 与PBI121 酶切产物的连接  35
      5.3.5 载体转化至大肠杆菌DH5a  35-36
    5.4 植物表达载体向农杆菌的转化  36-37
      5.4.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备  36
      5.4.2 液氮冻融法直接转化农杆菌  36
      5.4.3 阳性克隆的筛选和鉴定  36-37
  6 结果与分析  37-43
    6.1 目的基因的克隆与回收  37
    6.2 克隆载体的构建  37-38
    6.3 重组质粒的鉴定  38-39
    6.4 植物表达载体的构建  39-40
    6.5 植物表达载体的鉴定  40
    6.6 农杆菌的转化  40-43
    6.7 转化菌的鉴定  43
  7 讨论  43-46
    7.1 关于基因的克隆  43-44
    7.2 关于植物表达载体的构建  44
    7.3 关于农杆菌直接转化法及其鉴定  44-46
第三章 农杆菌介导的AFP、CBF2 基因对紫花苜蓿的转化及分子生物学检测  46-61
  1 试验材料  46-47
    1.1 植物材料  46
    1.2 质粒和农杆菌菌株  46
    1.3 农杆菌培养基  46
    1.4 培养基类型  46-47
    1.5 生化试剂  47
  2 试验方法  47-51
    2.1 无菌苗的获得  47
    2.2 筛选培养中卡那霉素选择压的确定  47
    2.3 筛选培养中抗生素种类及其浓度的抑菌作用  47-48
    2.4 农杆菌介导的基因转化方法  48-49
      2.4.1 菌种保存  48
      2.4.2 工程菌的纯化  48
      2.4.3 工程菌侵染悬浮液的制备  48
      2.4.4 侵染  48-49
    2.5 转化体系的建立  49
      2.5.1 侵染时间对转化率的影响  49
      2.5.2 农杆菌浓度对转化率的影响  49
      2.5.3 预培养时间对转化率的影响  49
      2.5.4 共培养时间对转化率的影响  49
    2.6 转基因愈伤组织的鉴定  49-51
      2.6.1 植物组织DNA 的提取  49-50
      2.6.2 PCR 反应体系  50-51
  3 结果与分析  51-57
    3.1 筛选培养中卡那霉素选择压的确定  51-52
    3.2 筛选培养基中抗生素浓度的确定  52-53
    3.3 转化体系的建立  53-56
      3.3.1 侵染时间对转化率的影响  53-54
      3.3.2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响  54-55
      3.3.3 预培养时间对转化效率的影响  55
      3.3.4 共培养时间对转化率的影响  55-56
    3.4 和田苜蓿转化愈伤组织的鉴定  56-57
      3.4.1 转AFP 基因愈伤组织的PCR 分子鉴定  56
      3.4.2 转CBF2 基因愈伤组织的PCR 分子鉴定  56-57
  4 讨论  57-61
    4.1 选择方法和选择时间对转化的影响  57-58
    4.2 抗生素对愈伤组织诱导的影响  58
    4.3 农杆菌菌株对转化的影响  58-59
    4.4 转化体系中各因素对转化的影响  59-60
    4.5 PCR 分子鉴定的局限性  60-61
第四章 结论  61-62
参考文献  62-70
致谢  70-71
作者简介  71-72
导师简介  72-73

相似论文

  1. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 抗吡虫啉—甲基对硫磷双特异性单克隆抗体的研究,S482.2
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  5. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  6. 军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达,Q786
  7. 企鹅珍珠贝Cd-MT酶联免疫检测方法的建立及试剂盒的初步研制,X835
  8. 甲型流感病毒M2蛋白的表达、纯化及其免疫原性的研究,R392
  9. 条纹斑竹鲨和鲫鱼BAFF基因的克隆和性质分析,S917.4
  10. 利用RNAi提高烟草对病毒的抗性及岷江百合遗传转化体系的初步构建,S435.72
  11. Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶发酵条件优化、纯化及基因的克隆表达,TQ925
  12. 氮肥对紫花苜蓿根系形态发育的影响,S541.9
  13. 紫花苜蓿根系生长与地上部生长的相关性分析,S541.9
  14. rd29A驱动RdreBlBI基因转化‘红颊’草莓的研究,S668.4
  15. 西藏地区紫花苜蓿和多年生黑麦草干草调制与贮藏技术的研究,S816.53
  16. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  17. STLV-1病毒间接ELISA方法建立及杂交瘤细胞株的筛选,R373
  18. Thermobifida Halotolerans YIM 90462~T木聚糖酶基因克隆表达以及酶学特性研究,Q78
  19. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  20. 害虫捕食性天敌拟环纹豹蛛烟碱型乙酰胆碱受体毒理学特性研究,S476.2
  21. 硅、硫对水稻砷吸收、积累的影响机制研究,S511

中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 饲料作物、牧草 > 多年生豆科牧草 > 其他
© 2012 www.xueweilunwen.com