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对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果

作　者: 刘君
导　师: 宋晓玲
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 益生菌 凡纳滨对虾 非特异性免疫 WSSV
分类号: S945
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


从上世纪六十年代以来,对虾养殖业在世界范围内得到了快速的发展,中国的对虾养殖业在经历了1993年的锐减之后,经过政府、研究人员和养殖者等多方的努力,又重新登上世界对虾养殖第一大国的位置。但是在这个辉煌业绩的背后,也出现了诸多问题,如对虾质量严重退化、免疫力低、抗病力差、虾病频发。虽然可以通过诸如改良种质、优化养殖技术等方式提高对虾的成活率,但是增强对虾的免疫机能是最为有效的解决途径之一。益生菌能提高动物的免疫机能,促进动物的健康,增强动物的抗病力。本实验分以下四个部分进行：美人鱼发光杆菌(Photobacterium sp.)和坚强芽孢杆菌(Bacillus sp.)对凡纳滨对虾免疫活性和抗病力的影响的比较研究：在基础饲料中分别添加分离自健康对虾肠道的美人鱼发光杆菌和坚强芽孢杆菌(菌含量不少于1011 CFU/g)的活菌和破碎菌各1g/kg,制备成菌含量不少于108 CFU/g的四组免疫饲料,做为免疫实验组。在本实验中,饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组凡纳滨对虾酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性显著高于其他实验组和对照组(P<0.05)；5d、10d时饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组凡纳滨对虾血清中过氧化氢酶(CAT)的活性显著高于对照组(P<0.05),其他组差异不显著；饲料中添加益生菌活菌和破碎菌的所有免疫组其究凡纳滨对虾超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于对照组(P<0.05)；饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组凡纳滨对虾溶菌酶显著高于对照组(P<0.05)。本实验中添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫组的抗WSSV存活率(0.49±0.15)显著高于对照组(P<0.05)。添加坚强芽孢杆菌活菌免疫组抗WSSV存活率(0.53±0.12)显著高于对照组的存活率。2株消化道共生菌对凡纳滨对虾抗WSSV感染能力的影响及最佳作用时间的研究：以基础饲料为对照组,在基础饲料中分别添加分离自健康对虾肠道分离的人苍白杆菌(O. anthropi)和粘着剑菌(Ensifer sp.)(菌含量≥1011 CFU/g)的活菌和破碎菌各1g/kg,制备成菌含量不少于108 CFU/g的免疫饲料,做为免疫实验组。在免疫10d、25d和35d后的对虾进行WSSV攻毒,益生菌对不同作用时间的对虾抗病力的影响,进而为益生菌的最佳作用时间提供理论依据；对免疫10d、25d的对虾,通过Taqman实时荧光定量PCR对益生菌影响WSSV在对虾宿主体内定殖进行初步探索。在本实验中,各实验组在感染后的前0-4天存活率差异不显著(P>0.05)；饲料中添加粘着剑菌免疫35d后,其感染WSSV的免疫保护率最高为41%±2.5%,显著高于对照组(P<0.05)。实验结果表明饲料中添加粘着剑菌持续35d后,能在一定程度上提高对虾的抗病力。利用TaqMan MGB探针分别检测了免疫10d和25d,感染WSSV的对虾体内WSSV变化情况,对照组在感染WSSV后,其体内WSSV的拷贝数变化呈递增趋势,由103递增到1011。其余免疫实验组WSSV拷贝数均在102-107范围内波动。美人鱼发光杆菌(Photobacterium sp.)和坚强芽孢杆菌(Bacillus sp.)的培养条件优化：本实验从不同碳源、碳源氮源的不同配比、无机盐成分的不同配比及培养基初始pH等方面进行了培养条件优化的研究,为美人鱼发光杆菌和坚强芽胞杆菌的大规模工业化生产提供基础理论依据。本实验的研究结果表明：美人鱼发光杆菌的最佳生长条件是：培养基初始pH值为7.6；最佳碳源为葡萄糖；不同碳源氮源的优化：通过正交试验,初步确定美人鱼发光杆菌的最优化碳源氮源成分为：葡萄糖0.5%(W/V),蛋白胨1.0%(W/V),牛肉膏0.2%(W/V),酵母膏0.5%(W/V)；不同无机盐的优化：通过正交试验,初步确定坚强芽孢杆菌的最优无机盐成分为：柠檬酸三钠1.0‰(W/V), K2HPO4 0.6‰(W/V), KH2PO4 0.1‰(W/V), MgSO4 0.8‰(W/V)。坚强芽孢杆菌的最佳生长条件是：培养基初始pH值为6.0；最佳碳源为蔗糖；不同碳源氮源的优化：通过正交试验,初步确定坚强芽孢杆菌的最优化碳源氮源培养基为：蔗糖0.5%(W/V),蛋白胨1.0%(W/V),牛肉膏0.5%(W/V),酵母膏0.1%(W/V)；不同无机盐的优化：通过正交试验,初步确定坚强芽孢杆菌的最优化无机盐培养基为：柠檬酸三钠0.7‰(W/V), K2HPO4 1.0‰(W/V), KH2PO4 0.4%‰(W/V), MgSO4 0.2‰(W/V)。美人鱼发光杆菌(Photobacterium sp.)和坚强芽孢杆菌(Bacillus sp.)在中国对虾肠道中定植效果的比较：在基础饲料中分别添加分离自健康对虾肠道的美人鱼发光杆菌和坚强芽孢杆菌(菌含量不少于1011 CFU/g)的活菌和破碎菌各1g/kg,制备成菌含量不少于108CFU/g的四组免疫饲料,做为免疫实验组。免疫实验10d后,对其肠道细菌进行分离培养,并进行16S rRNA测序、鉴定,研究不同时间内这株益生菌对虾肠道内定植的情况。在本实验中,饲料中添加美人鱼发光杆菌的免疫组,通过对凡纳滨对虾免疫10d后肠道优势菌进行分离培养,并进行16S rRNA测序、鉴定,结果为假单胞菌属(1.5x108cfu/g),与假单胞菌属比对(GenBank Accession No. GU396287),相似度为100%,占肠道细菌总数的80%；饲料中添加坚强芽孢杆菌的免疫组,鉴定结果为坚强芽孢杆菌(2.67x108cfu/g),与坚强芽孢杆菌比对(GenBank Accession No. GU826165),相似度为100%,占肠道细菌总数的76.2%；C组对照组,鉴定结果为弧菌属(4x108cfu/g),与弧菌属比对(GenBank Accession No.GQ406759),相似度为99%,占肠道细菌总数的70.6%。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-14
0 前言  14-32
  1 对虾的免疫机能的研究概况  14-22
    1.1 对虾的细胞免疫  14-17
    1.2 对虾的体液免疫  17-19
    1.3 小结  19
    参考文献  19-22
  2 益生菌对水产动物的作用研究进展  22-32
    2.1 益生菌作用机理  23-25
    2.2 益生菌在宿主肠道中的定植  25
    2.3 检测益生菌定植常用的方法  25-28
    2.4 展望  28
    参考文献  28-32
第一章 美人鱼发光杆菌(Photobacterium sp.)和坚强芽孢杆菌(Bacillus sp.)对凡纳滨对虾免疫活性和抗病力的影响的比较研究  32-51
  1.1 材料与方法  33-37
    1.1.1 实验对虾  33
    1.1.2 实验饲料  33-35
    1.1.3 实验分组  35
    1.1.4 对虾非特异性免疫指标的测定  35-37
    1.1.5 WSSV感染实验  37
    1.1.6 统计分析  37
  1.2 结果  37-45
    1.2.1 对虾血清免疫酶活性  37-43
    1.2.2 WSSV感染后凡纳滨对虾存活率  43-45
  1.3 讨论  45-47
    1.3.1 美人鱼发光杆菌和坚强芽孢杆菌对凡纳滨对虾非特异性免疫活性影响的比较  45-46
    1.3.2 美人鱼发光杆菌和坚强芽孢杆菌对凡纳滨对虾抗WSSV病毒影响的比较  46-47
  1.4 结论  47
  参考文献  47-51
第二章 2株消化道共生菌对凡纳滨对虾抗WSSV感染能力的影响及最佳作用时间的研究  51-61
  2.1 材料与方法  52-53
    2.1.1 实验对虾  52
    2.1.2 实验饲料  52
    2.1.3 实验分组  52-53
    2.1.4 病毒感染实验  53
    2.1.5 病毒定量检测  53
  2.2 结果  53-57
    2.2.1 对虾感染WSSV免疫保护率  53-54
    2.2.2 对虾感染WSSV累计死亡率  54-55
    2.2.3 WSSV Taqman real-time PCR  55-57
  2.3 讨论  57-59
  2.4 小结  59
  参考文献  59-61
第三章 美人鱼发光杆菌(Photobacterium sp.)和坚强芽孢杆菌(Bacillus sp.)培养条件的优化  61-74
  3.1 材料与方法  62-63
    3.1.1 种子液的制备  62
    3.1.2 种子培养基  62
    3.1.3 菌体产量的测定  62
    3.1.4 培养条件优化  62-63
  3.2 结果  63-72
    3.2.1 不同的碳源对细菌生长的影响  63-65
    3.2.2 碳源氮源的不同配比对细菌生长的影响  65-68
    3.2.3 无机盐成分的不同配比对细菌生长的影响  68-71
    3.2.4 培养基初始pH对细菌生长的影响  71-72
  3.3 小结  72-73
    3.3.1 美人鱼发光杆菌的最优生长条件  72-73
    3.3.2 坚强芽孢杆菌的最优生长条件  73
  参考文献  73-74
第四章 美人鱼发光杆菌和坚强芽孢杆菌在中国对虾肠道中定植效果的比较  74-92
  4.1 材料与方法  75-78
    4.1.1 实验对虾  75
    4.1.2 实验饲料  75
    4.1.3 实验分组  75
    4.1.4 样品采集  75
    4.1.5 样品处理  75-78
  4.2 结果  78-88
    4.2.1 细菌计数及优势菌的分离  78-79
    4.2.2 菌落PCR电泳结果  79-80
    4.2.3 肠道优势菌鉴定结果  80-88
  4.3 讨论  88-89
  4.4 小结  89
  参考文献  89-92
使用试剂的配制  92-94
硕士研究生期间已发表的文章  94-95
致谢  95

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治
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