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黄颡鱼肠道菌群分析和益生菌的研究

作　者: 周金敏
导　师: 陈孝煊
学　校: 华中农业大学
专　业: 水生生物学
关键词: 黄颡鱼肠道菌群益生菌益生作用
分类号: S917.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文在对黄颡鱼肠道菌群进行分析的基础之上,从中筛选能够对淡水鱼类常见致病菌有较强拮抗作用的潜在益生菌菌株,并对其特性进行研究,同时评估其在饲料中添加投喂对黄颡鱼生长、免疫和肠道菌群的影响,以期为益生菌在黄颡鱼配合饲料中的应用提供科学依据。主要结果如下：(1)对黄颡鱼肠道及所处水体菌群的数量和组成进行了分析。结果显示,黄颡鱼各肠段中好氧和兼性厌氧菌数量(对数值)分别为5.27±0.74、6.26±0.36、7.56±0.61。厌氧菌数量比好氧和兼性厌氧菌数量高2-3个数量级,优势菌群为双歧杆菌(Bifidobacterium)。养殖水体中细菌数量(对数值)为4.80±0.73。黄颡鱼肠道好氧和兼性厌氧菌与养殖水体中的优势菌群基本相同,均为气单胞菌属(Aeromonas)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和不动杆菌属(Acinetobacter)。此外,对患细菌性出血病的黄颡鱼肠道菌群的研究结果显示,患病鱼肠道细菌数量显著增加,气单胞菌相比健康黄颡鱼增加18.3%-33.6%,细菌种类明显减少。(2)采用脑心浸液培养基(BHI)从健康的黄颡鱼肠道分离到65株芽孢杆菌,平板点种法初筛获得53株能抑制淡水鱼类常见致病菌(柱状嗜纤维菌Cytophaga columnaris、迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、温和气单胞菌Aeromonas sobria、大肠杆菌Escherichia coli)的拮抗菌株,其抑菌圈直径范围为6.9-20.5(mm)。对抑菌活性较强的9个菌株用牛津杯法复筛获得3株拮抗菌,其对6株指示菌均有较强的拮抗作用。API 50CHB鉴定它们为枯草芽孢杆菌。选取F14进一步研究其温度耐受性、酸度耐受性、抗生素敏感性、代谢粗提物抑菌活性和在饲料中的存活率。结果显示：菌株F14在90℃水浴5min后存活率为95.3%左右,100℃水浴5min后存活率为52.97%,10min后存活率为8.26%；在pH3.0-5.0的范围内,处理1h后的存活率达到98%以上；处理2h后的存活率也可以达到87%以上；对15种药物药敏试验结果表明,F14对8种药物非常敏感,对4种药物较为敏感,而对3种药物不敏感；F14代谢粗提物具有较强的抑菌作用。病原性嗜水气单胞菌在粗提物中培养2h,细菌数量就开始急剧下降,至24 h时己检测不到活的菌体。此外,将F14喷洒在饲料中,分别存放于室温、4℃和-20℃条件下,10d后F14的存活率分别为：75.26%、87.42%和94.23%,20d后的存活率分别为：57.73%、77.53%和87.63%。(3)以基础饲料为对照组(A0),在养殖系统中进行为期60d的饲喂实验,研究饲料中添加107cfu/g (A1)、108cfu/g (A2)和109cfu/g (A3)的枯草芽孢杆菌F14对黄颡鱼生长、免疫和肠道菌群的影响。结果显示,不同浓度的F14均能提高黄颡鱼的生长性能,其中,A2组相对增重率和特定生长率最高(P<0.05),饵料系数最低。F14能够不同程度地提高黄颡鱼血液白细胞吞噬活性、溶菌酶活性、血清髓过氧化物酶(MPO)的活性和血清补体活性。与对照组相比,摄食F14后黄颡鱼肠道气单胞菌和大肠杆菌数量显著降低(P<0.05),芽孢杆菌的数量随投喂时间的延长显著增加(P<0.05),然后稳定在一个较高的水平,好氧和兼性厌氧菌数量也发生较大变化。结果表明,F14能够调节肠道菌群,激活黄颡鱼免疫防御体系,提高抗病力,促进生长。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
第一章文献综述  11-19
  1.1 鱼类肠道菌群的特点  11-12
  1.2 鱼类肠道菌群的作用  12-13
    1.2.1 营养功能  12
    1.2.2 防御功能  12-13
  1.3 益生菌及其在水产养殖中的应用  13-16
    1.3.1 益生菌的定义  13-14
    1.3.2 益生菌在水产养殖中的应用  14-16
      1.3.2.1 提高鱼体抗病力  14-16
      1.3.2.2 提供营养成分,促进生长  16
      1.3.2.3 改良水质  16
  1.4 益生菌筛选的方法论  16-17
  1.5 研究目的和意义  17-19
第二章黄颗鱼肠道及养殖水体中菌群的分析  19-25
  2.1 材料与方法  19-20
    2.1.1 供试鱼及培养基  19
    2.1.2 样品采集  19
    2.1.3 好氧和兼性厌氧菌的分离和鉴定  19-20
    2.1.4 厌氧菌的分离  20
    2.1.5 数据的统计和处理  20
  2.2 结果与分析  20-23
    2.2.1 健康黄颗鱼肠道和养殖水体中细菌的数量和组成  20-21
    2.2.2 患细菌性出血病的黄颗鱼肠道细菌的数量和组成  21-23
  2.3 讨论  23-25
第三章黄颗鱼肠道益生性芽袍杆菌的筛选和特性研究  25-35
  3.1 材料与方法  25-27
    3.1.1 材料  25
    3.1.2 芽袍杆菌的分离与纯化  25-26
    3.1.3 病原拮抗菌的筛选  26
    3.1.4 芽抱杆菌的鉴定  26
    3.1.5 拮抗菌的特性研究  26-27
      3.1.5.1 高温耐受性  26
      3.1.5.2 低pH耐受性  26
      3.1.5.3 药敏试验  26-27
      3.1.5.4 代谢粗提物的抑菌作用  27
      3.1.5.5 在饲料中的存活率  27
    3.1.6 数据的统计和处理  27
  3.2 结果与分析  27-32
    3.2.1 芽胞杆菌分离株对病原菌的抑制作用  27-28
    3.2.2 F13、F14和F15的形态特征及鉴定结果  28
    3.2.3 菌株F14的特性  28-32
      3.2.3.1 菌株F14对不同温度及处理时间的耐受能力  28
      3.2.3.2 菌株F14对低pH环境的耐受能力  28-30
      3.2.3.3 药敏试验结果  30-31
      3.2.3.4 F14代谢粗提物对嗜水气单胞菌的抑菌作用  31
      3.2.3.5 F14在饲料中的存活率  31-32
  3.3 讨论  32-35
第四章菌株F14对黄颗鱼生长、免疫和肠道菌群的影响  35-49
  4.1 材料与方法  35-38
    4.1.1 细菌培养  35
    4.1.2 实验饲料  35-36
    4.1.3 实验设计和动物饲养  36
    4.1.4 生长性能评估  36
    4.1.5 免疫指标测定  36-37
      4.1.5.1 制备血液样品  36
      4.1.5.2 制备吞噬原  36-37
      4.1.5.3 血液白细胞吞噬活性的测定  37
      4.1.5.4 溶菌酶活性的测定  37
      4.1.5.5 髓过氧化物酶(MPO)活性和血清补体(C_3、C_4)含量的测定  37
    4.1.6 肠道菌群分析  37
    4.1.7 攻毒  37
    4.1.8 数据统计分析  37-38
  4.2 结果  38-44
    4.2.1 菌株F14对黄颗鱼生长性能的影响  38
    4.2.2 菌株F14对黄颗鱼非特异性免疫功能的影响  38-41
      4.2.2.1 菌株F14对黄颗鱼血液白细胞吞噬活性的影响  38-39
      4.2.2.2 菌株F14对黄颡鱼血清溶菌酶活性的影响  39
      4.2.2.3 菌株F14对黄颡鱼血清髓过氧化物酶(MPO)活性的影响  39-40
      4.2.2.4 菌株F14对黄颡鱼血清补体(C_3、C_4)含量的影响  40-41
    4.2.3 菌株F14对黄颡鱼肠道菌群的影响  41-43
      4.2.3.1 肠道中气单胞菌的数量变化  41
      4.2.3.2 肠道中大肠杆菌的数量变化  41-43
      4.2.3.3 肠道中芽袍杆菌的数量变化  43
      4.2.3.4 肠道中好氧和兼性厌氧菌总数的变化  43
    4.2.4 攻毒后的死亡率  43-44
  4.3 讨论  44-49
参考文献  49-59
硕士期间发表的论文  59-60
致谢  60

黄颡鱼肠道菌群分析和益生菌的研究

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