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具有抑制单胺氧化酶作用的益生菌筛选

作　者: 王豪
导　师: 郭本恒
学　校: 上海海洋大学
专　业: 食品科学
关键词: 抗衰老益生菌单胺氧化酶筛选抑制活性
分类号: TQ460.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

人口老化是21世纪人类面临的一个主要难题。与衰老有关的疾病,比如老年痴呆症、帕金森氏综合症等,已逐渐成为人类健康的大敌和社会繁荣的沉重负担。当前,随着衰老人群的扩增,能提供益生作用,控制老化和延长寿命的功能性食品越来越受到青睐。乳酸菌尤其是乳杆菌作为一类公认为安全的食用菌(generally regarded as safe,GRAS),对人体健康的调节与促进作用在不断被发现与证实,其潜在的抗衰老作用逐渐引起广泛的关注。近年来关于益生菌降血脂、抗高血压、降胆固醇等改善心血管健康的功能已得到证实,但对于益生菌抗衰老作用的研究很少。其实早在1905年,著名的微生物学家梅契尼科夫就发现高加索地区的居民饮用乳酸菌制作的酸奶可以长寿,但目前益生菌的抗衰老研究尚在尝试利用动物模型进行干预实验,还未见有益生菌的体外抗衰老的研究报道,这可能是由于衰老的发生机制与生理生化改变比较复杂,故体外抗衰老的功能评价缺乏简单的衰老指标。单胺氧化酶(MAO)的主要功能是催化内源性和外源性单胺类物质的代谢,在人体中被认为是老化的标志,又称之为老化相关酶,该酶活性的不断升高会引起整个机体机能、尤其是脑功能的逐步退化、衰老。本研究以MAO作为靶位酶,建立了筛选具有抑制单胺氧化酶作用的益生菌的体外模型,可为今后进一步在体内评估益生菌抗衰老作用提供参考。MAO抑制剂意味着有潜在的抗衰老作用,本文对在体外具有抑制单胺氧化酶作用的益生菌活性成分进行了筛选。利用丙酮抽提技术和薄层色谱技术(TLC)对菌株细胞内含物进行了抽提并初步分离,测定不同分离组分对MAO的抑制活性,选取抑制效果最佳的组分送至国家新药筛选中心开展进一步的评估。最后对该菌株进行了相关的生理功能及生长特性研究,通过分子生物学手段及API碳水化合物发酵试验对筛选菌株进行了鉴定。筛选实验中菌株JH-23的细胞裂解物对MAO表现出很强的抑制活性,其初筛抑制率达到33.7%,在反应浓度为16mg/mL时抑制率可提高到53.2%。利用分子截留量为1 KD的透析袋将细胞裂解物进行透析,发现主要活性成分转移到了透析液中,说明发挥抑制作用的成分是菌体细胞内的小分子产物(MW<1 KD)。因此,采用丙酮抽提法对菌体细胞内具有MAO抑制作用的小分子物质进行提取。利用薄层色谱技术(TLC)对JH-23的胞内粗提物进行了提取分离,最终得到4组组分,其中组分Ⅰ对MAO的抑制作用最为显著,在反应浓度为120μg/mL时MAO抑制率达到55.4%,且有明显的剂量效应。将组分Ⅰ富集冻干后,送至国家新药筛选中心处进行MAO活性测定,确证组分Ⅰ对MAO有抑制作用。菌株JH-23厌氧生长,革兰氏阳性,细胞杆状,无芽孢。经16S rDNA序列比对及API碳水化合物发酵实验鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),命名为干酪乳杆菌JH-23。该乳杆菌具有较强的耐酸性、胆汁耐受力和NaCl耐受性,其最适生长温度为37℃,最适pH为6.0,在MRS培养基中生长旺盛,脱脂乳中生长缓慢且未凝乳。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第一章绪论  11-22
  1.1 引言  11-13
    1.1.1 益生菌的概述  11-12
    1.1.2 在衰老过程中主要的生理性变化  12-13
      1.1.2.1 氧化应激加剧  12-13
      1.1.2.2 免疫功能的下降  13
  1.2 益生菌潜在的抗衰老作用  13-17
    1.2.1 益生菌的免疫调节功能  13-14
    1.2.2 益生菌的抗氧化能力  14-16
    1.2.3 益生菌的抗衰老作用  16-17
  1.3 衰老评价模型  17-20
    1.3.1 几种主要的体内实验模型  17-18
      1.3.1.1 Klotho 基因缺陷衰老模型  17-18
      1.3.1.2 D-半乳糖致衰老模型  18
      1.3.1.3 SAMP 系小鼠快速衰老模型  18
    1.3.2 推荐的两种体外抗衰老评价模型  18-20
      1.3.2.1 单胺氧化酶抑制模型  18-19
      1.3.2.2 Caco-2 细胞模型  19-20
  1.4 本研究的重要意义和主要内容  20-22
    1.4.1 本研究的重要意义  20-21
    1.4.2 主要研究内容  21-22
第二章单胺氧化酶的制备及活性测定  22-27
  2.1 前言  22
  2.2 材料与方法  22-24
    2.2.1 Wistar 雄性老年大鼠  22-23
    2.2.2 试剂与药品  23
      2.2.2.1 试剂  23
      2.2.2.2 实验仪器与设备  23
    2.2.3 单胺氧化酶的制备  23-24
    2.2.4 单胺氧化酶的活性测定  24
    2.2.5 单胺氧化酶蛋白质含量测定  24
  2.3 结果  24-26
    2.3.1 抽提物中 MAO 活性测定  24-25
    2.3.2 单胺氧化酶蛋白质含量测定  25-26
  2.4 讨论  26
  2.5 本章小结  26-27
第三章具有抑制单胺氧化酶作用的益生乳酸菌筛选  27-39
  3.1 前言  27-28
  3.2 材料与方法  28-31
    3.2.1 实验菌种  28
    3.2.2 试剂与药品  28-29
      3.2.2.1 试剂  28-29
      3.2.2.2 实验仪器与设备  29
    3.2.3 乳酸菌的分离  29-30
      3.2.3.1 样品的采集  29-30
      3.2.3.2 MRS 平板分离  30
      3.2.3.3 菌株平板纯化  30
      3.2.3.4 菌株增菌扩培  30
      3.2.3.5 接触酶试验  30
    3.2.4 待筛样品的制备  30-31
    3.2.5 单胺氧化酶抑制剂活性的测定  31
    3.2.6 单胺氧化酶抑制剂量效关系的测定  31
    3.2.7 不同条件对单胺氧化酶抑制率的影响  31
      3.2.7.1 不同预保温时间  31
      3.2.7.2 不同分子量范围的菌株细胞裂解物  31
  3.3 结果  31-37
    3.3.1 人体粪便中乳酸菌的分离  31-33
    3.3.2 抑制单胺氧化酶的益生乳酸菌筛选  33-35
    3.3.3 菌株JH-23 的细胞裂解物对单胺氧化酶活性抑制的量效关系  35-36
    3.3.4 抑制剂和单胺氧化酶的不同预保温时间对该酶抑制率的影响  36
    3.3.5 不同分子量范围的细胞裂解物对单胺氧化酶的抑制影响  36-37
  3.4 讨论  37-38
  3.5 本章小结  38-39
第四章菌株 JH-23 中抑制单胺氧化酶的活性物质分离研究  39-51
  4.1 引言  39-40
  4.2 材料与方法  40-42
    4.2.1 实验菌种  40
    4.2.2 试剂与药品  40-41
      4.2.2.1 试剂  40
      4.2.2.2 实验仪器与设备  40-41
    4.2.3 丙酮抽提法制备菌株JH-23 的无细胞提取物  41
    4.2.4 丙酮提取物的全波长扫描及量效关系测定  41
    4.2.5 丙酮提取物的分离  41
    4.2.6 分离组分的MAO 抑制活性及量效关系的测定  41
    4.2.7 国家新药筛选中心单胺氧化酶活性测定  41-42
  4.3 结果  42-48
    4.3.1 丙酮提取物的全波长扫描  42
    4.3.2 丙酮提取物的量效关系测定  42-43
    4.3.3 丙酮提取物的分离研究  43-45
      4.3.3.1 分析型薄层色谱  43-44
      4.3.3.2 制备型薄层色谱  44-45
    4.3.4 经TLC 分离得到的各组分MAO 抑制活性测定  45-46
    4.3.5 分离组分的量效关系测定  46-47
    4.3.6 国家新药筛选中心鉴定报告  47-48
  4.4 讨论  48-49
  4.5 本章小结  49-51
第五章具有抑制单胺氧化酶作用的益生乳酸菌生长特性研究和菌种鉴定  51-74
  5.1 前言  51-52
  5.2 材料与方法  52-55
    5.2.1 实验菌株  52
    5.2.2 试剂与药品  52-53
      5.2.2.1 试剂  52
      5.2.2.2 试验仪器与设备  52-53
    5.2.3 菌株JH-23 的生长特性研究  53-55
      5.2.3.1 菌株耐酸能力测定  53
      5.2.3.2 菌株胆盐耐受能力的测定  53
      5.2.3.3 菌株对 NaCl 耐受性的测定  53-54
      5.2.3.4 菌株最适生长温度和最适生长pH 值的测定  54
      5.2.3.5 菌株生长最适接种量的测定  54
      5.2.3.6 菌株产酸能力检验和生长曲线的绘制  54
      5.2.3.7 菌株保藏特性研究方法  54
      5.2.3.8 菌株的药敏性试验  54-55
    5.2.4 乳酸菌的鉴定  55
      5.2.4.1 实验菌株的培养特征  55
      5.2.4.2 实验菌株的生化特性  55
      5.2.4.3 实验菌株的16s rDNA 序列分析  55
  5.3 结果  55-70
    5.3.1 菌株生长特性研究  55-66
      5.3.1.1 菌株 JH-23 耐酸性实验  55-56
      5.3.1.2 菌株耐胆盐实验  56-57
      5.3.1.3 菌株 JH-23 的 NaCl 耐受性  57-58
      5.3.1.4 菌株 JH-23 的最适生长温度  58-59
      5.3.1.5 菌株 JH-23 的最适生长pH 值  59-60
      5.3.1.6 菌株 JH-23 的生长最适接种量  60-61
      5.3.1.7 菌株 JH-23 生长曲线的测定  61-63
      5.3.1.8 菌株 JH-23 在4 ℃的保藏特性  63-64
      5.3.1.9 菌株 JH-23 的药敏性实验  64-66
    5.3.2 抑制单胺氧化酶的益生菌JH-23 的菌种鉴定结果  66-70
      5.3.2.1 JH-23 的菌落形态观察  66
      5.3.2.2 JH-23 的菌体形态  66-67
      5.3.2.3 JH-23 的液体培养特征  67
      5.3.2.4 JH-23 的生化特性  67-70
      5.3.2.5 JH-23 的 16s rDNA 全序列分析  70
  5.4 讨论  70-73
  5.5 本章小结  73-74
全文主要结论  74-75
问题与展望  75-76
参考文献  76-81
致谢  81-82
攻读硕士学位期间发表的论文清单  82

具有抑制单胺氧化酶作用的益生菌筛选

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