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翻译后修饰多肽及蛋白在质谱中的信号增敏研究

作　者: 程智慧
导　师: 曹胜利；李艳梅
学　校: 首都师范大学
专　业: 物理化学
关键词: 磷酸化蛋白质 β-消除/Michael-加成 MALDI-TOF MS
分类号: O629.73
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 18次
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内容摘要

蛋白质的翻译后修饰是一种调节蛋白质定位、功能、翻转的正常生理机制。大量的翻译后修饰已经被报道,其中蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种翻译后修饰方式。蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程,包括细胞的增殖、发育、凋亡和分化以及信号转导等。为了能够更好的在分子水平上研究这些生理过程,知道蛋白质磷酸化的状态是十分必要的,因此发展更具有选择性和更为敏感的测定蛋白质磷酸化位点的方法相当重要。质谱由于其高灵敏度,高准确性,以及操作方便且不需要放射性标签等优势,成为蛋白质结构解析的主要方法。但是由于以下原因,用质谱进行常规的磷酸化蛋白质表征的广泛应用仍然存在制约。其一由于磷酸基团自身带有的负电荷抑制了多肽在质谱中的离子化效率,在质谱的正离子模式下,特征峰的信号很低,难以被检测到。另外,在蛋白质酶解混合中,相对于非磷酸化多肽,磷酸化多肽化学含量非常低,质谱测定磷酸化肽的信号很容易被非磷酸化肽的质谱信号覆盖。利用磷酸化丝氨酸、苏氨酸在碱性条件下可以发生β-消除,以及进一步的Michael加成反应,引入一些对离子化效率没有影响或者可以增强质谱信号的基团,是目前这一领域研究的热点。本文引入了一些含巯基和氨基的亲核加成试剂,用这些分子通过β-消除/Michael加成取代带有负电荷的磷酸基团,使得多肽在质谱中的离子化效率明显增强,质谱图中信号也明显增强。并依次对这些分子和多肽发生加成后的增敏效果做了对比,消除反应可以在氢氧化钡的作用下进行完全,而加成的效果取决于加成试剂以及多肽的序列。实验结果表明,乙硫醇对各种磷酸化肽的消除加成后的结果相对于磷酸化肽在质谱中都得到了明显的增敏。另外还用这些分子对糖基化多肽进行消除加成反应,加成后的多肽在质谱中的信号也有明显增强。总之,本文通过发展蛋白质化学修饰技术,主要利用“β-消除/Michael加成”,开发有效的亲核试剂和广谱的反应条件对多肽的磷酸化位点进行标记,质谱测定中,用化学的方法重新修饰的磷酸化肽的信号很容易就可以检测出来,不再被非磷酸化肽的质谱信号覆盖,利于通过质谱鉴定磷酸化位点。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第1章引言  7-19
  1.1 蛋白质组学  7-8
  1.2 蛋白质磷酸化简介  8-10
    1.2.1 蛋白质磷酸化的发展  9-10
    1.2.2 蛋白质磷酸化在生物体中的重要性  10
  1.3 蛋白质磷酸化的研究方法  10-15
    1.3.1 固定金属亲和色谱法  11-14
    1.3.2 金属氧化物亲和色谱  14-15
  1.4 质谱技术的简介  15-17
    1.4.1 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱  15-16
    1.4.2 电喷雾质谱  16-17
  1.5 本论文的研究内容  17-19
    1.5.1 课题的提出  17-18
    1.5.2 硕士期间主要工作  18-19
第2章实验方法  19-29
  2.1 试剂和仪器  19-20
    2.1.1 主要试剂  19
    2.1.2 主要仪器  19-20
  2.2 化学小分子的合成  20
  2.3 多肽的合成与纯化  20-26
    2.3.1 Fmoc 法固相合成多肽  20-22
    2.3.2 多肽的分离和纯化  22
    2.3.3 Fmoc 法合成模型多肽  22-26
  2.4 化学方法对多肽进行修饰  26-28
    2.4.1 多肽消除假阳性  27-28
    2.4.2 磷肽的消除加成  28
  2.5 模型蛋白的酶解及修饰  28-29
    2.5.1 模型蛋白的酶解  28
    2.5.2 模型蛋白的修饰  28-29
第3章化学修饰对多肽信号增敏的研究  29-50
  3.1 模型多肽的选择  29-35
    3.1.1 模型多肽kemptide  29-32
    3.1.2 普通多肽消除的假阳性  32-35
  3.2 磷酸化肽化学修饰后增敏效果研究  35-45
    3.2.1 磷肽和内标的信号对比图  35-37
    3.2.2 磷肽及糖肽消除产物的增敏  37-39
    3.2.3 不同的化学修饰对多肽pS 的增敏效果对比  39-43
    3.2.4 不同的化学修饰对多肽pT 的增敏效果对比  43-45
  3.4 糖基化肽化学修饰后增敏效果研究  45-48
    3.4.1 不同的化学修饰对多肽gS 的增敏效果对比  45-47
    3.4.2 不同的化学修饰对多肽gT 的增敏效果对比  47-48
  3.5 本章小结  48-50
第四章蛋白的酶解及化学修饰  50-64
  4.1 模型蛋白的酶解  50-53
  4.2 化学修饰在蛋白酶解混合肽中的增敏效应  53-57
    4.2.1 乙硫醇对α-酪蛋白酶解产物的增敏  53-54
    4.2.2 乙二硫醇对α-酪蛋白酶解产物的增敏  54-55
    4.2.3 氨基加成试剂对α-酪蛋白酶解产物的增敏  55-57
  4.3 串联质谱测定修饰位点的研究  57-63
    4.3.1 多肽pS 和pT 裂解  59-61
    4.3.2 串联质谱测定α-casein 修饰位点  61-63
  4.4 本章小结  63-64
参考文献  64-67
硕士期间发表论文  67-68
致谢  68-69
附录A 论文图表索引  69-72

翻译后修饰多肽及蛋白在质谱中的信号增敏研究

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