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解淀粉芽孢杆菌YN-1抑制植物病原真菌活性物质研究

作　者: 邓建良
导　师: 李国庆；刘红彦
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 解淀粉芽孢杆菌脂肽抗生素鉴定 HPLC MALDI-TOF-MS
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

从郑州郊区果园土壤中筛选出一株芽孢杆菌菌株YN-1,该菌株具有广谱拮抗植物病原真菌作用,其发酵液在121℃下高压灭菌20min,然后在4℃下储存半年,仍然保持对多种植物病原真菌良好的抑菌活性。通过形态学观察、生理生化特征鉴定、以及16SrDNA和ITS序列同源性分析表明该菌属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。通过综合分析推测发酵液中可能含有生化特性稳定的脂肽抗生素。本研究包括3个方面的研究内容:1.利用已知的脂肽抗生素合成相关基因序列设计4对特异引物对解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株基因组进行基因检测。2.按照脂肽抗生素分离纯化方法定向对菌株YN-1发酵液活性物质进行提取,获得粗提物质。研究粗提取物质的生化特性,并对粗提物质是否为解淀粉芽孢杆菌YN-1发酵液的主要成分进行验证。3.利用HPLC对活性粗提物质进行检测,探索活性粗提物质分离实验参数,然后以获得的HPLC分离参数为依据,利用HPLC-ESI-MS和MALDI-TOF-MS检测对活性粗提物进行定性定量分析。结果表明:1.解淀粉芽孢杆菌YN-1基因组中含有sfp、fenB、ituA或bamA基因;2.菌株YN-1发酵液粗提物特性与脂肽抗生素一致:具有广谱抑制植物病原真菌活性,并且对温度、对蛋白酶K不敏感。另外通过实验证实粗提物质为菌株YN-1发酵液广谱抗植物病原真菌物质的主要组分。3.通过梯度洗脱得到峰型较好、分辨率高的HPLC色谱图,获得活性粗提物质HPLC分离参数。LC-ESI-MS和MALDI-TOF-MS检测分析表明活性粗提物中含有C14-IturinA、C15-ImrinA、C16-IturinA、C14-FengycinA、C15-FengycinA、C16-FengycinA、C17-FengycinA、C16-FengycinB、C17-FengycinB九种脂肽抗生素,其中C16-IturinA、C14-FengycinA、C16-FengycinA、C17-FengycinA、C17-FengycinB五种脂肽抗生素为活性粗提物中主要成分(＞5%)。这些结果为利用菌株YN-1及揭示其防治植物真菌病害奠定了基础。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-9
第一章文献综述  9-25
  1 生物农药及其发展前景  9-12
    1.1 生物农药  9
    1.2 微生物活体农药  9-10
    1.3 微生物代谢产物农药  10
    1.4 植物次生代谢物质农药  10
    1.5 动物源农药  10-11
    1.6 抗病虫草害的转基因植物  11
    1.7 生物农药发展前景  11-12
  2 芽孢杆菌在植物病害生物防治中的应用和主要作用机制  12-15
    2.1 芽孢杆菌在植物病害生物防治中的应用  12-13
    2.2 芽孢杆菌生物防治主要作用机制  13-15
      2.2.1 营养和空间位点的竞争  13
      2.2.2 拮抗作用  13-14
      2.2.3 溶菌作用  14
      2.2.4 诱导植物抗性  14
      2.2.5 促进植物生长  14-15
  3 生防芽孢杆菌脂肽抗生素的研究概况  15-24
    3.1 前言  15
    3.2 生防芽孢杆菌脂肽抗生素的种类及特性  15-19
    3.3 脂肽抗生素基因工程研究  19-20
    3.4 脂肽抗生素的分离纯化  20-21
    3.5 脂肽抗生素的MALDI-TOF-MS 鉴定  21-23
      3.5.1 MALDI-TOF-MS简介  21
      3.5.2 脂肽抗生素肽质量指纹谱分析技术鉴定  21-23
    3.6 展望  23-24
  4 研究的目的和意义  24-25
第二章脂肽抗生素合成相关基因克隆测序  25-33
  1 材料和方法  25-29
    1.1 材料  25-26
      1.1.1 菌株  25
      1.1.2 引物  25
      1.1.3 克隆和转化菌株  25-26
      1.1.4 试剂及酶类  26
      1.1.5 试剂盒  26
      1.1.6 供试仪器  26
    1.2 方法  26-29
      1.2.1 菌株YN-1基因组DNA提取  26
      1.2.2 PCR扩增  26-27
      1.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物  27
      1.2.4 DNA片段的切胶纯化  27
      1.2.5 PCR扩增产物和pMD18-T克隆载体的连接  27-28
      1.2.6 大肠杆菌感受态细胞制备  28
      1.2.7 连接反应物对宿主感受态细胞的转化  28
      1.2.8 菌落PCR鉴定  28
      1.2.9 序列分析  28-29
  2 结果与分析  29-31
    2.1 PCR扩增结果  29
    2.2 测序结果核苷酸序列同源性分析  29-30
    2.3 sfp基因的氨基酸序列分析  30-31
  3 小结与讨论  31-33
    3.1 小结  31
    3.2 讨论  31-33
第三章菌株YN-1抗菌物质提取及抑菌活性  33-45
  1 材料与方法  33-37
    1.1 材料  33-34
      1.1.1 生防菌株  33
      1.1.2 病原菌  33
      1.1.3 植物材料  33
      1.1.4 试剂及溶剂配制  33-34
      1.1.5 主要仪器  34
      1.1.6 培养基  34
    1.2 方法  34-37
      1.2.1 菌株YN-1发酵液粗提物制备  34-35
        1.2.1.1 菌株YN-1发酵罐发酵  34
        1.2.1.2 菌株YN-1发酵液粗提物制备  34-35
      1.2.2 菌株YN-1发酵液粗提物特性  35-36
        1.2.2.1 粗提物质抑制菌丝生长  35
        1.2.2.2 粗提物质对植物病原真菌抑菌谱  35
        1.2.2.3 粗提物质抑制核盘菌菌核萌发  35
        1.2.2.4 粗提物质防治小麦白粉病菌  35-36
        1.2.2.5 粗提物质对热、蛋白酶K的稳定性研究  36
      1.2.3 菌株YN-1抗真菌物质的活性测定  36
      1.2.4 数据统计分析  36-37
  2 结果与分析  37-44
    2.1 菌株YN-1发酵液粗提物质特性  37-43
      2.1.1 粗提物质抑制菌丝生长  37-38
      2.1.2 粗提物质植物病原真菌抑菌谱  38
      2.1.3 粗提物质抑制核盘菌菌核萌发  38-41
      2.1.4 粗提物质对小麦白粉病菌防治效果  41-42
      2.1.5 粗提物质对温度、蛋白酶K的稳定性  42-43
    2.2 活性提取物为发酵液中广谱抗真菌物质活性物质验证  43-44
  3 小结与讨论  44-45
    3.1 小结  44
    3.2 讨论  44-45
第四章菌株YN-1活性粗提物质分离纯化及检测  45-55
  1 材料与方法  45-46
    1.1 材料  45
      1.1.1 指示菌株  45
      1.1.2 主要试剂及培养基  45
      1.1.3 主要仪器  45
    1.2 方法  45-46
      1.2.1 菌株YN-1发酵液活性粗提物HPLC分离  45
      1.2.2 HPLC分离获得组份活性检测  45-46
      1.2.3 菌株YN-1发酵液粗提活性物质的粗定量和定性  46
        1.2.3.1 活性粗提物质HPLC-ESI-MS检测  46
        1.2.3.2 活性粗提物质MALDI-TOF-MS检测  46
  2 结果与分析  46-54
    2.1 菌株YN-1发酵液活性粗提物HPLC分离  46-47
    2.2 菌株YN-1发酵液活性粗提物质的粗定量和定性  47-54
      2.2.1 活性粗提物质HPLC-ESI-MS检测  47-50
      2.2.2 活性粗提物质MALDI-TOF-MS检测  50-54
  3 小结与讨论  54-55
    3.1 小结  54
    3.2 讨论  54-55
参考文献  55-61
附录  61-65
致谢  65

解淀粉芽孢杆菌YN-1抑制植物病原真菌活性物质研究

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