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蛋白质组学方法识别RKIP作为鼻咽癌的转移抑制蛋白

作　者: 陈彦
导　师: 肖志强
学　校: 中南大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 鼻咽癌蛋白质组磷酸化蛋白质组 Raf酶抑制蛋白转移抑制蛋白侵袭转移核因子κB MEK ERK 信号传导通路二维凝胶电泳质谱
分类号: R739.63
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方地区(广东、广西、湖南、福建、江西)常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居世界首位,是一种中国特色癌,严重危害国人的生命和健康。NPC几乎均为低分化鳞癌和未分化癌,恶性程度高,易早期发生颈部淋巴结和远处转移,而且NPC放疗后局部残灶复发、远处转移亦是制约其疗效和预后的瓶颈。因此,转移是NPC患者死亡的主要原因,但NPC转移的分子机制至今仍然不清楚,发现NPC转移相关分子对于揭示NPC转移机制、指导NPC治疗、改善NPC预后具有十分重要的作用。高通量的组学技术是发现肿瘤相关分子的重要手段。如cDNA芯片分析NPC的基因表达谱已发现一些与NPC发病有关的异常表达基因。蛋白质是细胞的功能分子,因此,蛋白质组学技术在识别肿瘤发生发展相关蛋白质、发现肿瘤分子标志物和治疗靶标方面具有独特的优势。为筛选NPC发病相关的蛋白质,本研究开展了如下3个方面的研究工作:1、NPC组织与癌旁正常鼻咽上皮组织(adjacent normal nasopharyngealepithelial tissue,ANNET)的差异蛋白质组学研究:以10例配对的NPC组织和ANNET为样本,采用二维凝胶电泳(two-dimensional gelelectrophoresis,2-DE)技术分离组织的总蛋白质,图像分析识别NPC组织和ANNET差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾电离-四极杆-串联质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)鉴定差异表达的蛋白质。结果共鉴定了21个差异蛋白质,其中Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP)等9个蛋白质在NPC组织中的表达水平显著低于ANNET。2、NPC组织与正常鼻咽上皮组织(normal nasopharyngeal epithelialtissue,NNET)的差异磷酸化蛋白质组学研究:以10例NPC组织和10例NNET为样本,采用2-DE分离组织的总蛋白质,蛋白质转膜后与抗酪氨酸磷酸化抗体进行2D Western blotting分析,图像分析识别差异磷酸化蛋白质点,ESI-Q-TOF MS/MS鉴定差异酪氨酸磷酸化蛋白质,采用NetPhos软件预测蛋白质的酪氨酸磷酸化位点,采用1-D Westernblotting对差异磷酸化蛋白质RKIP进行验证。结果共鉴定了13个差异酪氨酸磷酸化蛋白质,其中RKIP等6个蛋白质在NPC组织中的磷酸化水平显著低于NNET。3、RKIP在NPC转移中的作用和机制研究:为探讨RKIP在NPC转移中的作用和机制,采用Western blotting检测RKIP在不同转移潜能的5-8F和6-10B NPC细胞中的表达水平;采用免疫组化方法检察RKIP在石蜡包埋NPC组织、NNET及颈淋巴结转移NPC组织(lymphnode metastaticNPC,LMNPC)中的表达水平;采用脂质体转染方法将正义、反义RKIP表达质粒及其相应空白载体分别转染5-8F和6-10B细胞,建立相应的稳定转染细胞系,分析RKIP表达水平改变对NPC细胞体外侵袭能力以及Raf-1/MEK/ERK和NF-κB信号通路活性的影响。结果显示:RKIP在高转移5-8F细胞中的表达水平低于非转移6-10B细胞、在NPC组织中的表达水平低于NNET、在LMNPC中表达缺失。上调RKIP表达能抑制5-8F细胞的体外侵袭能力,而下调RKIP表达能增强6-10B细胞的体外侵袭能力;上调RKIP表达能降低5-8F细胞Raf-1/MEK/ERK和NF-κB信号通路活性,而下调RKIP表达能增强6-10B细胞Raf-1/MEK/ERK和NF-κB信号通路活性。研究结果表明,RKIP可能是NPC的转移抑制蛋白,RKIP表达下调/缺失可能通过活化化Raf-1/MEK/ERK和NF-κB信号通路促进NPC转移,本研究初步揭示了RKIP在NPC侵袭和转移中的作用和机制,为RKIP作为防治NPC转移的靶标提供了实验依据。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
缩写词简表  11-13
第一章鼻咽癌组织与癌旁正常鼻咽上皮组织的差异蛋白质组学研究  13-39
  1.1 前言  13-16
  1.2 材料与方法  16-27
  1.3 结果  27-30
  1.4 讨论  30-33
  1.5 小结  33-34
  参考文献  34-39
第二章鼻咽癌组织与正常鼻咽上皮组织的差异磷酸化蛋白质组研究  39-58
  2.1 前言  39-42
  2.2 材料和方法  42-45
  2.3 结果  45-50
  2.4 讨论  50-53
  2.5 小结  53-54
  参考文献  54-58
第三章 RKIP蛋白在鼻咽癌转移中的作用和机制  58-77
  3.1 前言  58-63
  3.2 材料与方法  63-69
  3.3 结果  69-74
  3.4 讨论  74-76
  3.5 小结  76-77
结论  77-78
参考文献  78-82
综述  82-94
致谢  94-95
攻读学位期间主要的研究成果  95

蛋白质组学方法识别RKIP作为鼻咽癌的转移抑制蛋白

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