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多层键合磷酸锆开管毛细管柱制备及在磷酸肽富集分析中的应用

作　者: 王璐
导　师: 张养军；周兰兰
学　校: 安徽医科大学
专　业: 药理学
关键词: 多层开管毛细管柱磷酸锆磷酸化蛋白质组磷酸肽富集基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

可逆的磷酸化过程在细胞增殖、分化、代谢、细胞间通讯以及信号转导通路等重要的生物学过程中发挥着重要的调节作用,真核细胞中,有近25-30%的蛋白在其生活史中会经历磷酸化过程。因此,蛋白质的磷酸化修饰是翻译后修饰蛋白质组研究中的热点之一。目前,包括MALDI源和ESI源在内的质谱仪以其高灵敏度、准确度和分辨率而被广泛用于蛋白质组学研究中。由于磷酸化蛋白在生物体内含量很低,且在质谱分析时易受到非磷酸肽的干扰,因而磷酸肽和磷酸化蛋白质的富集成为磷酸化肽段和磷酸化蛋白质分析的一个关键步骤。目前已经有很多富集磷酸肽的方法和技术,但这些方法在应用时仍然存在不少问题,因而需要发展新的富集方法,以满足大规模磷酸化蛋白质组分析的需要。基于此,本文开展了一种磷酸肽富集的新方法研究,并将其应用于复杂样品的分析。本课题发展的方法为一种利用键合磷酸锆开管毛细管柱的制备及用于快速富集磷酸肽的新方法。其过程是通过酸碱活化熔融石英毛细管内表面,使其带有自由的硅羟基,在硅羟基表面引入3-氨丙基三乙氧基硅烷,之后再分别引入甲基丙烯酸甲酯和乙二胺,如此进行三轮反应后,在形成的树枝状大分子表面进行磷酸基团修饰并与锆离子生成磷酸盐,最终合成具有特异性吸附磷酸肽分子的多层开管毛细管柱。进一步对该多层开管毛细管柱的富集条件进行了优化,确定出当开管毛细管柱长度为50 cm时,标准磷酸肽的进样流速在0.3μL/min -0.5μL/min时,均有很好的富集效果。并且在同样的流速条件下,使用不同内径的多层开管柱进行富集时,富集效果没有显著性差异。同时还考察了强阳离子交换色谱分离中分离效果较好的盐,如氯化铵对富集效果的影响,以便该方法与复杂样本的预分离过程相兼容。之后,还用合成的磷酸肽段(FLpTEYVATR)与外标法相结合,对开管毛细管柱的负载量和回收率等进行考察,确定出负载量为48 pmol,回收率为94.1%(50 cm×50μm)。利用α酪蛋白与BSA混合酶切溶液,考察了毛细管开管柱的选择性和检测灵敏度,结果表明此方法对磷酸肽有较高的选择性,且检测限达到10-9M。在优化的实验条件下,利用牛α酪蛋白对开管毛细管柱的富集性能进行考察,实验结果显示α酪蛋白的理论磷酸化位点覆盖率达到100%。最后,通过将所建富集和质谱鉴定方法用于小鼠肝脏全蛋白磷酸化蛋白质组的富集和分析,结果表明此功能化的开管毛细管柱可以有效用于复杂样本中磷酸化肽的富集。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
第一章前言  11-16
  1.1 蛋白质磷酸化意义  11-12
  1.2 磷酸化蛋白质研究现状  12-13
  1.3 本论文研究意义  13-16
第二章功能化多层键合磷酸锆开管毛细管柱的制备  16-27
  2.1 前言  16-17
  2.2 实验部分  17-21
    2.2.1 试剂与材料  17
    2.2.2 标准蛋白质酶切  17-18
    2.2.3 仪器  18
    2.2.4 多层键合磷酸锆开管毛细管柱的制备  18-21
    2.2.5 多层键合磷酸锆开管毛细管柱内部结构的电镜表征  21
    2.2.6 多层键合磷酸锆开管毛细管柱和单层键合磷酸锆开管毛细管柱富集效果比较  21
  2.3 结果与讨论  21-26
    2.3.1 α酪蛋白的富集  22-23
    2.3.2 单层开管毛细管柱和多层开管毛细管柱内部结构比较  23-24
    2.3.3 多层键合磷酸锆开管毛细管柱和单层键合磷酸锆开管毛细管柱富集效果的比较  24-26
  2.4 本章小结  26-27
第三章多层键合磷酸锆开管毛细管柱富集条件的优化  27-34
  3.1 前言  27
  3.2 柱径和进样流速对富集的影响  27-31
    3.2.1 实验部分  27-28
    3.2.2 结果讨论  28-31
      3.2.2.1 进样流速对多层开管毛细管柱富集效果的影响  28-29
      3.2.2.2 柱径对多层开管毛细管柱富集效果的影响  29-31
  3.3 盐对富集的影响  31-32
    3.3.1 实验部分  31
    3.3.2 结果讨论  31-32
  3.4 本章小结  32-34
第四章多层键合磷酸锆开管毛细管柱的富集性能评价  34-43
  4.1 前言  34
  4.2 试剂与材料  34
  4.3 单层和多层开管毛细管柱的负载量和回收率的比较  34-37
    4.3.1 负载量和回收率测定方法  35
    4.3.2 单层和多层开管毛细管柱的负载量和回收率测定实验  35
    4.3.3 结果与讨论  35-37
  4.4 单层和多层开管毛细管柱的选择性富集性能和最低富集浓度的比较  37-40
  4.5 盐的存在对较复杂样品富集效果的影响  40-42
  4.6 本章小结  42-43
第五章多层键合磷酸锆开管毛细管柱在小鼠肝脏全蛋白磷酸化蛋白质组中的应用  43-61
  5.1 前言  43
  5.2 实验部分  43-48
    5.2.1 试剂与材料  43-44
    5.2.2 仪器和设备  44
    5.2.3 样品制备  44-46
      5.2.3.1 酵母全蛋白的提取、定量  44-45
      5.2.3.2 小鼠肝脏全蛋白的提取、定量  45
      5.2.3.3 蛋白酶切  45-46
    5.2.4 强阳离子交换色谱分离条件优化  46-47
      5.2.4.1 前言  46
      5.2.4.2 实验方法  46-47
    5.2.5 磷酸肽的富集  47
    5.2.6 质谱分析  47-48
    5.2.7 数据检索  48
  5.3 结果与讨论  48-59
    5.3.1 强阳离子交换色谱中上样量对分离度的影响  48-50
    5.3.2 强阳离子交换色谱中盐的种类对分离度的影响  50-52
    5.3.3 强阳离子交换色谱中调节流动相pH 值的酸的种类对分离度的影响  52-55
    5.3.4 强阳离子交换色谱中有机溶剂的比例对分离度的影响  55-57
    5.3.5 鼠肝全蛋白磷酸化蛋白质组分析的技术策略  57
    5.3.6 鼠肝全蛋白强阳离子交换色谱分离条件的选择与分离结果  57-58
    5.3.7 鼠肝全蛋白磷酸化蛋白质组鉴定结果  58-59
  5.4 本章小结  59-61
参考文献  61-65
附录  65-66
在学期间发表的论文  66-67
致谢  67-68
综述  68-77

多层键合磷酸锆开管毛细管柱制备及在磷酸肽富集分析中的应用

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