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蛋白质组技术在小麦谷蛋白分离与鉴定中的应用

作　者: 刘丽
导　师: 何中虎；夏先春；马武军
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 普通小麦蛋白质组麦谷蛋白亚基 SDS-PAGE 双向电泳 MALDI-TOF-MS 加工品质
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

小麦谷蛋白是面筋的主要成分之一,对加工品质有着重要决定作用。由于低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)组成复杂,等位变异丰富,不同实验室间缺乏统一判定标准与命名,对LMW-GS特别是Glu-A3和Glu-D3位点亚基的鉴定结果存在较大差异,单个LMW-GS对品质的贡献大小尚未达成共识。因此LMW-GS亚基的标准命名体系与分离方法对于LMW-GS的组成鉴定及与品质的关系研究具有重要意义。收集了主要文献中常用于高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)和LMW-GS研究的国际小麦品种103份以及我国秋播麦区主栽品种与高代品系233份,利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术以及蛋白质组核心技术双向电泳(2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS),分析HMW-GS和LMW-GS组成,建立了LMW-GS亚基的标准命名体系,验证了MALDI-TOF-MS质谱技术在HMW-GS和LMW-GS鉴定中的应用潜力与可行性。主要结果如下:1.同时利用SDS-PAGE、2-DE和MALDI-TOF-MS分析LMW-GS组成,建立了LMW-GS亚基的标准命名系统。在LMW-GS的鉴定中,2-DE分辨率最高,能够检测到的等位变异最丰富,2-DE和MALDI-TOF-MS皆能够准确鉴定Glu-A3位点的Glu-A3e和Glu-A3f亚基。此外,用2-DE能够检测出稀有亚基Glu-A3g。三种方法对Glu-B3位点亚基的鉴定结果基本一致。在Glu-D3位点,SDS-PAGE检测到的Glu-D3d亚基,用2-DE和MALDI-TOF-MS检测不到,但用2-DE检测到了较Glu-D3c亚基少一个蛋白点的Glu-D3c*亚基。共鉴定出22个等位变异,其中Glu-A3位点7个,包括Glu-A3a、Glu-A3b、Glu-A3c、Glu-A3d、Glu-A3e、Glu-A3f和Glu-A3g,Glu-B3位点10个,包括Glu-B3a、Glu-B3b、Glu-B3b*、Glu-B3c、Glu-B3d/i(/表示不能明确区分的亚基类型,下同)、Glu-B3g、Glu-B3g*、Glu-B3h、Glu-B3i*和Glu-B3j,Glu-D3位点5个,包括Glu-D3a、Glu-D3b、Glu-D3c、Glu-D3c*和Glu-D3f。2. MALDI-TOF-MS是分析HMW-GS组成的高效、快速质谱技术,对于Glu-B1位点等位变异如7a*、7b*、8a*、8b*和7OE等SDS-PAGE不能区分的亚基鉴定特别有效,能够快速鉴定与超强筋小麦密切相关的亚基7OE。用MALDI-TOF-MS质谱技术在Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点分别检测到1个、15个和4个等位变异,其中Glu-B1位点的等位变异包括6+8b*、7、7+8、7+8a*、7+8b*、7a*+8、7b*+8、7OE、7OE+8、7OE+8a*、7OE+8b*、7+9、13+16、14+15 or 20和17+18亚基。在参试材料中检测到6个7+8a*、6个7+8b*和4个7OE+8a*亚基,在Aca 601、冀麦24和绵阳940112中检测到7OE+8b*亚基,在ProINTA Isla Verde、济麦20和Opata中检测到13+16亚基,在Eshimashinriki和烟475中检测到7b*+8亚基,在Orca中检测到7单亚基,在济麦19中检测到7a*+8亚基。优质亚基7OE+8在我国小麦品种中的频率较低,仅为3.4%,这可能是我国小麦面筋品质较差的主要原因之一。3. MALDI-TOF-MS质谱技术是LMW-GS鉴定的重要方法之一,适于LMW-GS的大规模鉴定,在品种快速鉴定中具有广阔的应用前景。MALDI-TOF-MS质谱分析表明,LMW-GS的分子量约为30-43 kDa,Glu-A3位点亚基的特征峰主要分布于分子量较高的41.8-42.1 kDa区和43.5-43.8 kDa区,Glu-B3位点亚基的特征峰主要分布于40.1-40.2 kDa区和42.8-43.3 kDa区,Glu-D3位点亚基的特征峰主要分布于分子量较低的33.2-33.7 kDa区。MALDI-TOF-MS质谱技术能够鉴定的LMW-GS等位变异有15个,Glu-A3位点5个,包括Glu-A3a/c、Glu-A3b、Glu-A3d、Glu-A3e和Glu-A3f,Glu-B3位点5个,包括Glu-B3b、Glu-B3d、Glu-B3f/g、Glu-B3h和Glu-B3j,Glu-D3位点5个,包括Glu-D3a、Glu-D3b、Glu-D3c、Glu-D3c’/d和Glu-D3f。其中MALDI-TOF-MS对Glu-A3e和Glu-A3f亚基的鉴定较SDS-PAGE有效。本试验同时利用SDS-PAGE技术以及蛋白质组核心技术2-DE和质谱技术分析LMW-GS组成,建立了LMW-GS亚基的标准命名系统。首次利用MALDI-TOF-MS质谱技术对我国秋播麦区小麦品种的HMW-GS和LMW-GS进行大规模深入系统的研究,并与SDS-PAGE电泳结果相比较,以进一步验证MALDI-TOF-MS质谱技术在麦谷蛋白亚基的鉴定中应用的可行性与可靠性。上述结果对小麦品质改良有重要指导意义。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-13
第一章文献综述  13-29
  1 小麦蛋白质组学研究  14-25
    1.1 从基因组学到蛋白质组学  14
    1.2 蛋白质组学  14-15
    1.3 双向电泳技术  15-18
    1.4 质谱鉴定技术  18-19
    1.5 N-末端氨基酸测序  19-20
    1.6 蛋白质组技术改良研究  20-22
    1.7 蛋白质组技术在小麦蛋白研究中的应用  22-25
  2 小麦谷蛋白研究存在的问题  25-28
    2.1 LMW-GS 命名系统  25-27
    2.2 HMW-GS 的MALDI-TOF-MS 鉴定  27-28
    2.3 LMW-GS 的MALDI-TOF-MS 鉴定  28
  3 本研究的目的和意义  28-29
第二章低分子量麦谷蛋白亚基标准命名体系研究  29-49
  1 供试材料  30-31
  2 试验方法  31-35
    2.1 SDS-PAGE 分析LMW-GS  31
    2.2 2-DE 鉴定LMW-GS  31-33
    2.3 MALDI-TOF-MS 鉴定LMW-GS  33-35
  3 结果与分析  35-45
    3.1 SDS-PAGE 分析LMW-GS 组成  35-39
    3.2 2-DE 鉴定LMW-GS  39-44
    3.3 MALDI-TOF-MS 识别LMW-GS  44-45
    3.4 LMW-GS 标准命名体系  45
  4 讨论  45-48
  5 结论  48-49
第三章MALDI-TOF-MS 和SDS-PAGE 在HMW-GS鉴定中的比较  49-60
  1 试验材料  50
  2 试验方法  50-52
    2.1 SDS-PAGE 分析HMW-GS  50-52
    2.2 MALDI-TOF-MS 鉴定HMW-GS  52
    2.3 统计分析  52
  3 结果与分析  52-58
    3.1 SDS-PAGE 分析HMW-GS 组成  52-53
    3.2 MALDI-TOF-MS 分析HMW-GS 的特征  53-55
    3.3 MALDI-TOF-MS 分析HMW-GS 的等位变异  55-57
    3.4 比较分析MALDI-TOF-MS 与SDS-PAGE 在HMW-GS 鉴定中的应用  57-58
  4 讨论  58
  5 结论  58-60
第四章MALDI-TOF-MS 在LMW-GS鉴定中的应用  60-70
  1 供试材料  61
  2 试验方法  61
  3 结果与分析  61-68
    3.1 SDS-PAGE 分析LMW-GS 组成  61-63
    3.2 MALDI-TOF-MS 分析LMW-GS 的特征  63-66
    3.3 MALDI-TOF-MS 分析LMW-GS 的等位变异  66-67
    3.4 比较分析MALDI-TOF-MS 与SDS-PAGE 在LMW-GS 鉴定中的应用  67-68
  4 讨论  68-69
  5 结论  69-70
第五章结论  70-72
参考文献  72-92
致谢  92-93
作者简历  93
近期发表和待发表论文  93-94

蛋白质组技术在小麦谷蛋白分离与鉴定中的应用

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