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脂类组学方法分析非律平菌素和制霉菌素对人FL细胞鞘脂类代谢的影响

作　者: 刘广义
导　师: 杨军
学　校: 浙江大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 甲基硝基亚硝基胍非律平菌素制霉菌素脂类组学 MALDI-TOF-MS 酸性鞘磷脂酶鞘磷脂合成酶丝氨酸棕榈转移酶
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

系统生物学(systems biology)是一门新的快速发展的研究领域。它通过对于一个细胞或者一个生物体内所有物质分子定量的分析以及这些分子之间相互作用的研究，从而达到从系统水平对于整个生物体或细胞的生物反应的理解。因此，它需要对于所有生物物质分子的高通量的鉴定技术，例如基因组学(genomics)和蛋白组学(proteomics)是分别对DNA／RNA和蛋白质进行高通量的分析的方法。最近，一个新的概念“脂类组学(lipidomics)”被提出。它主要是利用质谱(mass spectrometry，MS)技术对脂类进行高通量的分析。利用脂类组学的方法，我们实验室研究了烷化剂甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)对于鞘脂类代谢的影响。本实验室的研究发现MNNG可以引起膜表面受体肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的聚簇，而且这种聚簇过程主要发生在脂筏(lipid raft)上，鞘脂类(sphingolipids)在此过程中发挥了主要作用。通过脂类组学方法的分析，发现MNNG导致细胞鞘脂类代谢发生了很大的改变。脂类研究过程中各种脂类代谢的干扰剂是研究脂类代谢非常有效的方法，例如：丙咪嗪(imipramine)是酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase，ASM)的抑制剂，它可以抑制细胞中鞘磷脂转化为神经酰胺的反应，导致细胞内神经酰胺含量降低。非律平菌素(filipinI)和制酶菌素(nystatin)也是我们在脂类研究过程中常用的两种脂类干扰剂，它们主要干扰细胞脂筏结构导致细胞的功能失调。然而它们具体是通过什么途径来干扰细胞的脂类代谢我们还不清楚。所以，我们利用脂类组学的技术研究了filipin和nystatin对细胞鞘脂类代谢的影响，以及它们对MNNG所诱导的生物学效应的影响。filipin和nystatin对FL细胞鞘脂类代谢的影响FL细胞分别用两种不同浓度的filipin和nystatin处理30分钟后，提取细胞鞘脂并用基质辅助激光解离—飞行时间质谱技术(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight MS，MALDI-TOF-MS)分析细胞鞘脂的改变。结果：filipin处理细胞的浓度分别是0.2μg／mL和10μg／mL，低浓度处理组中m／z 536、580、624、660、720等出现，表明有新的神经酰胺分子合成。而在m／z750—900的范围内的几种鞘脂类分子的峰没有改变，表明filipin对鞘磷脂分子的代谢影响较小，而对于神经酰胺代谢的影响大。高浓度处理组细胞鞘脂的变化与低浓度组的结果一致，表明以上两个剂量的filipin对细胞鞘脂代谢的影响没有剂量效应。nystatin处理细胞的浓度分别为50μg／mL和100μg／mL，低剂量处理组中在m／z750—900的范围内812、834和836的强度都有所增强，表明Nystatin可激活鞘磷脂的合成，在m／z 500—750的范围内，m／z 612、660、676、720等出现。高剂量处理组中细胞鞘脂代谢的改变与低剂量结果相似，但也存在差异，即100μg／mL nystatin也可抑制鞘磷脂的水解，并诱导新的神经酰胺分子的合成。但其诱导神经酰胺的合成作用与50μg／mL相比更强一些，有两种新分子m／z 552和658被诱导。filipin和nystatin对MNNG诱导的鞘脂类改变的影响我们实验室前期研究中发现MNNG可以导致膜受体TNFR和EGFR的聚簇，并且用脂类组学的技术发现鞘脂类在这个过程中发挥着主要作用。而脂筏结构的干扰剂nystatin可抑制MNNG引起的膜受体的聚簇。但nystatin是如何抑制了MNNG引起的膜受体的聚簇我们并不清楚，所以我们就利用脂类组学的方法分析了filipin和nystatin如何干扰MNNG引起的细胞鞘脂类代谢改变。试验中细胞分为7组，分别为空白对照组、溶剂对照组、MNNG(10μM)处理组、filipin(10μg／mL)处理组、nystatin(100μg/mL)处理组、MNNG(10μM)和filipin(10μg/mL)共同处理组及MNNG(10μM)和nystatin(100μg/mL)共同处理组。质谱分析后，我们发现MNNG、filipin和nystatin三者单纯处理细胞都可引起鞘脂类代谢的改变，而以MNNG的影响尤其显著。但用filipin或nystatin预处理后再用MNNG处理，可发现许多MNNG单独处理时被诱导的鞘脂类分子被抑制。比如，m／z 567.5在MNNG和filipin共同处理组中被抑制；m／z 572.2在MNNG和filipin共同处理组和MNNG和nystatin共同处理组中均被抑制；m／z606.1在MNNG和nystatin共同处理组被抑制。对于部分有显著改变的峰，我们根据本实验室建立的小型的鞘脂类质谱数据库进行了对比，对它们可能的结构式进行了推测。MNNG、filipin和nystatin对FL细胞鞘脂类代谢通路中关键酶表达的影响上面的试验中我们发现MNNG、filipin和nystatin均可以引起细胞鞘脂类代谢的改变，然而它们到底影响的细胞鞘脂类代谢的哪些通路我们还不清楚。所以，我们选取了细胞鞘脂类代谢途径中的三个关键酶，即丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)、酸性鞘磷脂酶(ASM)和鞘磷脂合成酶(SMS)进行RT-PCR分析。试验中细胞共分为以下各组：MNNG(10μM)处理组、filipin(10μg／mL)处理组、nystatin(100μg／mL)处理组、MNNG(10μM)和filipin(10μg／mL)共同处理组、MNNG(10μM)和nystatin(100μg／mL)共同处理组，处理时间为30分钟。鞘磷脂合成酶、丝氨酸棕榈酰转移酶以及酸性鞘磷脂酶在各处理组的表达与blank相比均无显著性差异。结论：一、filipin和nystatin都可对细胞鞘脂类代谢发生影响。根据filipin和nystatin作用后神经酰胺和鞘磷脂的不同变化，我们可以根据鞘脂类代谢的通路，推测区分二者干扰其代谢的不同靶点，为进一步的深入研究提供信息。二、filipin和nystatin对于MNNG引起的FL细胞鞘脂类代谢的改变具有抑制作用。MNNG、filipin和nystatin对FL细胞脂类代谢的影响主要不是通过改变酶的表达来实现的。

全文目录

缩略语  3-4
中文摘要  4-7
英文摘要  7-10
前言  10-14
实验材料  14-16
实验方法  16-22
实验结果  22-38
讨论  38-43
参考文献  43-46
综述  46-59
附录  59-60
致谢  60

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