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应用RNA干扰和蛋白质组学技术研究鼻咽癌细胞中p53的功能

作　者: 孙懿
导　师: 陈主初
学　校: 中南大学
专　业: 病理与病理生理学
关键词: p53 鼻咽癌蛋白质组学 RNA干扰二维电泳 MALDI-TOF-MS ESI-Q-TOF-MS
分类号: R739.63
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是常见的恶性肿瘤之一，好发于东南亚地区及我国南方各省市。病因学研究表明，鼻咽癌的发生与EB病毒感染、遗传易感性、饮食习惯及某些环境理化因素有关。鼻咽癌的发生是一个多基因参与、多步骤的复杂过程，其中抑癌基因失活和癌基因活化是肿瘤发生的重要原因。p53基因是极为重要的抑瘤基因，是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，它能与特异性DNA序列结合并激活靶基因转录，具有阻滞细胞周期、启动细胞凋亡、维持基因组稳定性的作用。p53基因失活是多种肿瘤发生发展过程中的重要事件，至少50％以上的人类肿瘤存在p53基因高频率突变失活。与其他肿瘤相比，鼻咽癌中很少发生p53基因突变，但60％以上的鼻咽癌组织和几乎100％的鼻咽癌细胞株有p53蛋白高表达／聚集。有研究报道，p53蛋白过表达／聚集与鼻咽癌组织增生、血管密度、颅底侵袭、颈部淋巴结转移和患者预后密切相关，提示鼻咽癌中过表达的p53蛋白功能可能异常或失活，不能发挥阻滞细胞周期和诱导凋亡的生物学作用，但至今过表达的p53蛋白在鼻咽癌所发挥的功能以及其聚集的机制仍然不清楚，有待进一步地研究。RNA干扰(RNA imerference，RNAi)技术是一种靶基因表达沉默技术，也称为靶蛋白质剔除技术，在基因功能研究中它不仅可以和基因敲除技术媲美，而且具有快速、简便的优势，目前已广泛用于基因功能的研究。本研究应用RNAi技术稳定沉默鼻咽癌细胞系CNE2的p53基因的表达，通过分析打靶细胞中p53靶基因p21、MDM2表达及其细胞表型(细胞周期、细胞凋亡、细胞生物学特征)和放射敏感性的改变来探讨CNE2细胞中p53有无功能。然后采用高通量的蛋白质组学技术分离、鉴定稳定沉默p53基因表达的CNE2细胞株与空白载体转染的对照细胞株中差异表达的蛋白质，以寻找与p53功能相关的蛋白质。主要结果如下。(一)成功地构建了表达siRNAs的质粒pSUPER／sip53，建立了稳定沉默p53基因表达的CNE2sip53鼻咽癌细胞系和空白载体转染的CNE2／pSUPER鼻咽癌细胞系。稳定沉默p53基因表达后，经实时荧光定量PCR检测发现，两株p53干扰效果较好的细胞株CNE2sip53-1与CNE2sip53-2中p53的表达分别下调达99.9％和97.5％，p53靶基因p21下调达79.5％和74.7％、MDM2下调达81.9％和77.1％。而且6Gy照射后，经Western blot检测，稳定干扰p53的细胞系与对照细胞系(未转染的CNE2和CNE2／pSUPER细胞)相比，p21和MDM2蛋白的表达水平均明显下降，结果说明CNE2细胞中的p53具有转录调控功能。细胞生物学特性分析结果显示：(1)与对照组细胞CNE2比较，CNE2sip53-1和CNE2sip53-2细胞周期进程加快，G1期减少，S期增加，G1∶S比值分别下降了33.9％与26.4％(p＜0.05)，而CNE2／pSUPER细胞无明显改变；(2)CNE2sip53-1、CNE2sip53-2的生长速度比对照细胞的生长速度明显加快；(3)CNE2sip53-1、CNE2sip53-2的平板集落形成率分别为73％与72％，与对照组CNE2和CNE2／pSUPER的平板集落形成率43％与42％相比，有显著性差异(p＜0.01)；(4)CNE2sip53-1、CNE2sip53-2的软琼脂集落形成率分别为37％与34.1％，与对照组CNE2和CNE2／pSUPER软琼脂集落形成率20.5％与22.1％相比，有显著性差异(p＜0.01)；(5)与对照细胞比较，CNE2sip53-1细胞的裸鼠成瘤时间较早，且移植瘤体积明显增大(CNE2，1.22±0.25mm~3，n=6；CNE2／pSUPER，1.09±0.29mm~3，n=6；CNE2sip53-1，2.55±0.71mm~3，n=6，p＜0.01)。采用照射不同剂量后各组细胞的存活分数绘制细胞存活曲线，多靶单击模型拟合数据以及Hoechest 33258染色观察细胞凋亡的方法，分析稳定沉默p53基因表达的CNE2鼻咽癌细胞的放疗敏感性的变化，结果显示：CNE2sip53-1，CNE2sip53-2细胞2Gy照射后的存活分数值分别为0.65和0.66，放射增敏比(SER)分别为0.79和0.78；而对照组CNE2和CNE2／pSUPER细胞2Gy照射后的存活分数值为0.41和0.40。6 Gy照射后CNE2sip53-1，CNE2sip53-2凋亡率分别为69.1％与68.4％，与对照组CNE2和CNE2／pSUPER凋亡率52.1％与53.2％相比，有显著性差异(p＜0.05)。结果说明：稳定干扰CNE2细胞中p53的表达后，细胞生长速度加快，体内和体外增殖的能力加强，而放疗敏感性降低，CNE2细胞中的p53具有抑瘤功能。(二)采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2D)技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析和电喷雾串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)分离鉴定了22个在CNE2sip53(即CNE2sip53-1)与CNE2／pSUPER细胞中差异表达的蛋白质。其中14种蛋白质包括HSP27，14-3-3σ，GRP78，HSP70等在CNE2sip53细胞中表达上调，8种蛋白质包括hnRNP K，eIF4B，TPT1等在CNE2sip53细胞中表达下调。Western blot分析验证了部分蛋白质如HSP27、14-3-3 0和GRP75在两株细胞系中的差异表达水平。免疫共沉淀结合Western blot分析证实部分蛋白质如HSP27，HSP70，GRP75和GRP78为CNE2细胞中p53蛋白的相互作用蛋白质。此外，HSP27反义核酸抑制CNE2细胞HSP27的表达后能下调p53的表达。结果说明：22个差异表达蛋白质可能与CNE2细胞的p53功能相关。综上所述，稳定沉默鼻咽癌细胞系CNE2的p53基因表达可导致p53靶基因p21、MDM2表达及其细胞表型和放射敏感性的改变，这表明鼻咽癌细胞中高表达／聚集的p53蛋白仍然具有转录调控功能和抑瘤作用。采用蛋白质组技术从CNE2细胞中鉴定了22个可能与p53功能相关的蛋白质，其中HSP27，HSP70，GRP75和GRP78可能通过与p53蛋白相互作用引起CNE2细胞中的p53蛋白高表达／聚集。研究结果不仅证实鼻咽癌细胞中高表达的p53蛋白具有抑瘤功能，而且为研究鼻咽癌的p53蛋白聚集的机制提供了重要依据和线索。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-13
缩写词简表  13-16
第一章:应用RNA干扰技术研究鼻咽癌细胞中p53的功能  16-53
  1.1 前言  16-20
  1.2 材料与方法  20-34
  1.3 结果  34-49
  1.4 讨论  49-53
第二章:应用蛋白质组学技术分离鉴定鼻咽癌CNE2中p53功能相关的蛋白质  53-85
  2.1 前言  53-57
  2.2 材料与方法  57-70
  2.3 结果  70-81
  2.4 讨论  81-85
结论  85-86
参考文献  86-96
综述  96-108
攻读学位期间主要的研究成果  108-110
致谢  110

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 耳鼻咽喉肿瘤 > 咽肿瘤
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