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牛白细胞介素2基因克隆、表达及多克隆抗体的制备

作　者: 盖仁华
导　师: 李广兴
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 白细胞介素-2 原核表达多克隆抗体 MTT
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 104次
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内容摘要

牛白细胞介素2主要是由辅助性T淋巴细胞产生的一种淋巴因子,通过免疫网络调控机体免疫功能,在机体免疫反应中起着极为重要的作用。因其具有免疫增强剂、抗肿瘤和抗感染的特点是理想的免疫佐剂和免疫治疗剂。但正常情况下,机体产生的BoIL-2的量非常有限,一定程度上限制了对BoIL-2的研究和应用。本实验主要应用重组DNA和基因表达技术,通过RT-PCR方法克隆BoIL-2基因,并对其基因序列进行分析和表达,旨在为大量制备和生产高效价廉的BoIL-2,为其生物学活性及应用研究奠定基础。根据Genbank发表的BoIL-2基因序列,设计了一对引物。以ConA刺激的外周血淋巴细胞(PMN)为材料,提取总RNA,应用RT-PCR的方法,扩增BoIL-2基因序列。琼脂糖凝胶电泳显示目的片段约为477bp。测序结果显示,克隆的BoIL-2基因与Genbank发表的BoIL-2基因序列同源性为98.7%,氨基酸同源性为99.4%。将测序正确的pMD-18-T-IL-2重组质粒及pET30a(+)载体,用EcoRI及SalI进行双酶切,分别回收后T4连接酶进行连接,转化、提取重组质粒。通过双酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒进行序列测定后在大肠杆菌的表达,分子量约为23.49ku;表达产物主要分布在包涵体中。Western Blot证实所得到的重组蛋白为BoIL-2重组蛋白。通过MTT法测定BoIL-2重组蛋白的活性,可知重组BoIL-2(rBoIL-2)对牛及山羊淋巴细胞有明显作用,对猪淋巴细胞作用不明显。用镍离子亲和树脂对所得的BoIL-2重组蛋白进行纯化,并免疫新西兰兔成功制备兔抗rBoIL-2多克隆抗体,为下阶段的研究提供了重要的实验材料。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-21
  1.1 细胞因子概述  11-16
    1.1.1 细胞因子研究概况  11-12
    1.1.2 细胞因子的产生  12
    1.1.3 细胞因子的共同特性  12-13
    1.1.4 细胞因子在兽医学中的应用  13-16
  1.2 BOIL-2 的研究进展  16-19
    1.2.1 IL-2 及IL-2R 的结构特点  16-17
    1.2.2 IL-2 的生物学功能  17
    1.2.3 IL-2 的应用  17-19
  1.3 研究目的与意义  19-21
2 材料与方法  21-34
  2.1 实验材料  21-22
    2.1.1 实验动物  21
    2.1.2 菌种与载体  21
    2.1.3 工具酶和主要试剂  21
    2.1.4 其它相关试剂  21
    2.1.5 标准参照物  21
    2.1.6 主要试剂的配制  21-22
    2.1.7 仪器设备  22
  2.2 实验方法  22-33
    2.2.1 从牛外周血淋巴细胞中分离总RNA  22-23
    2.2.2 BoIL-2 基因RT-PCR 扩增  23-24
    2.2.3 PCR 扩增片段的克隆  24-26
    2.2.4 重组质粒的鉴定  26-27
    2.2.5 原核表达载体的构建  27-28
    2.2.6 重组质粒的鉴定  28-29
    2.2.7 重组BoIL-2 在大肠杆菌表达系统中的诱导表达  29-30
    2.2.8 免疫印记（Western-blot）分析  30-31
    2.2.9 重组蛋白的纯化  31
    2.2.10 纯化蛋白的复性  31
    2.2.11 MTT 法测重组蛋白的生物活性  31-32
    2.2.12 多克隆抗体的制备  32
    2.2.13 多克隆抗体的鉴定  32-33
  2.3 数据处理  33-34
3 结果  34-47
  3.1 牛外周血淋巴细胞中分离总RNA  34
  3.2 RT-PCR 法扩增编码 BoIL-2 基因序列  34-35
  3.3 PCR 产物的纯化与回收  35-36
  3.4 重组质粒 pMD-18-T-IL-2 的鉴定  36-40
    3.4.1 重组质粒pMD-18-T-IL-2 菌落PCR 鉴定  36
    3.4.2 重组质粒pMD-18-T-IL-2 的限制性内切酶鉴定  36
    3.4.3 重组质粒pMD-18-T-IL-2 的PCR 鉴定  36-37
    3.4.4 重组质粒pMD-18-T-IL-2 的测序结果及分析  37-40
  3.5 BoIL-2 基因在大肠杆菌中的表达及多克隆抗体的制备  40-47
    3.5.1 重组表达质粒的鉴定  40-41
    3.5.2 重组蛋白的表达、鉴定与纯化  41-44
    3.5.3 MTT 法测定BoIL-2 重组蛋白的生物活性  44-45
    3.5.4 多克隆抗体的制备  45-47
4 讨论  47-50
  4.1 BOIL-2 基因的克隆与序列分析  47-48
  4.2 BOIL-2 在大肠杆菌中的表达与纯化  48
  4.3 复性重组蛋白生物学活性的测定  48-49
  4.4 多克隆抗体的制备及鉴定  49-50
5 结论  50-51
致谢  51-52
参考文献  52-58
攻读硕士学位期间发表的学术论文  58

牛白细胞介素2基因克隆、表达及多克隆抗体的制备

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