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rBTI-2的表达及其抗肿瘤活性研究

作　者: 郭慧
导　师: 李玉英
学　校: 山西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: rBTI-2 抗肿瘤 蛋白酶抑制剂 MTT检测 细胞迁移
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor, TI)普遍存在于植物、动物及微生物体内。TI在生物体内的很多生理系统中起着关键性的调控作用,是维持体内环境稳定的重要因素。迄今为止,多种TI已经陆续地被分离鉴定,并对其结构和功能进行了深入研究,许多TI在农业和医药领域中得到广泛地应用,尤其是作为一种潜在抗癌药物,受到越来越多研究者的青睐。目前,已经研发的蛋白酶抑制剂药物多数来源于人和动物,如人尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)、抑肽酶,但是由于它们分子量大,结构复杂,分离提取难度大等特点,在治疗作用方面存在诸多不足之处。相比之下,植物来源的TI由于分子量较小,来源丰富,功能多等特点,越来越受到广泛地关注。根据氨基酸序列的同源性可以将植物TI分为Bowman-Birk、Kunitz、PotatoⅠ、PotatoⅡ、Serpin、Cereal和STI等家族,其中对Bowman-Birk、Kunitz和PotatoI家族的研究较为深入。荞麦是我国传统的作物,氨基酸含量丰富,营养价值高,具有降低胆固醇、降血压、抗衰老、改善糖尿病等功能,作为一种保健食品受到越来越多的关注。本课题组前期采用RT-PCR和RACE法,获得荞麦胰蛋白酶抑制剂的基因序列,构建原核表达载体,获得一种带6个His标签的重组融合蛋白rBTI。体外研究表明,rBTI能够抑制不同肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡,而对正常细胞影响很小。为了将荞麦胰蛋白酶抑制剂开发为一种适合基因工程生产的抗肿瘤药物,本研究选用pExSecI作为表达载体,构建无标签的原核表达质粒pExSecI-BTI-2,表达纯化后得到高纯度rBTI-2蛋白,作用于肿瘤细胞,初步研究结果表明,rBTI-2能显著抑制人肝癌细胞株HepG2、人食管癌细胞株EC9706和胆管癌细胞株QBC-939的增殖,并且呈剂量依赖的效应,而对正常人肝细胞株HL-7702影响很小。同时rBTI-2能够显著提高细胞内活性氧ROS水平。细胞迁移实验还发现,低浓度的rBTI-2蛋白能不同程度的抑制HepG2细胞的迁移。通过比较rBTI-2与rBTI及其突变体aBTI、fBTI和R,D-rBTI对肿瘤细胞的作用,结果表明rBTI-2和几种融合蛋白对肿瘤细胞的生长都有明显的抑制作用,并随着作用时间的增加,其增殖抑制率也明显增加,相同摩尔浓度下,rBTI-2蛋白的抑制率要高于rBTI。为将rBTI-2蛋白今后的大规模生产奠定基础,我们进一步优化其表达条件,在最佳诱导剂浓度和诱导时间分别为0.5 mmol/L和3.5 h,可获得高产量的rBTI-2蛋白。这为深入研究BTI诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制及其应用开发提供了重要基础和研究依据。

全文目录


摘要  10-12ABSTRACT  12-14第一章 文献综述  14-23  1.1 引言  14  1.2 胰蛋白酶抑制剂概述  14-16    1.2.1 胰蛋白酶抑制剂的来源  14-15    1.2.2 胰蛋白酶抑制剂生物学功能的研究  15-16  1.3 胰蛋白酶抑制剂的抗肿瘤研究进展  16-21    1.3.1 胰蛋白酶抑制剂对肿瘤细胞凋亡影响的研究  16-18    1.3.2 胰蛋白酶抑制剂抑制肿瘤细胞侵袭与迁移的作用  18-21    1.3.3 荞麦胰蛋白酶抑制剂的抗肿瘤研究  21  1.4 本论文的研究目的及意义  21-23第二章 rBTI-2的表达及鉴定  23-30  2.1 引言  23  2.2 实验材料  23-24    2.2.1 菌株和质粒  23    2.2.2 主要工具酶及试剂  23    2.2.3 实验仪器  23-24  2.3 实验方法  24-26    2.3.1 pExSecI-BTI-2原核表达载体的构建  24    2.3.2 rBTI-2蛋白的表达与纯化  24-25    2.3.3 rBTI-2蛋白表达条件的优化  25-26    2.3.4 rBTI-2蛋白的Western blot鉴定  26    2.3.5 rBTI-2抑制胰蛋白酶活性的测定  26  2.4 实验结果  26-28    2.4.1 rBTI-2原核表达载体的构建  26-27    2.4.2 rBTI-2的表达与纯化  27    2.4.3 rBTI-2蛋白表达条件的优化  27    2.4.4 rBTI-2蛋白的Western blot鉴定  27-28    2.4.5 rBTI-2抑制胰蛋白酶活性的测定  28  2.5 讨论  28-30第三章 rBTI-2蛋白对肿瘤细胞增殖和迁移的作用  30-42  3.1 引言  30  3.2 实验材料  30-31    3.2.1 细胞株和主要试剂  30-31    3.2.2 实验仪器  31  3.3 实验方法  31-33    3.3.1 细胞培养  31-32    3.3.2 rBTI-2抑制肿瘤细胞生长的MTT检测  32    3.3.3 煮沸不同时间的rBTI-2抑制肿瘤细胞生长的MTT检测  32    3.3.4 倒置显微镜观察细胞生长的变化  32    3.3.5 细胞核形态学的检测  32    3.3.6 几种突变体蛋白抑制HepG2细胞生长的MTT检测  32-33    3.3.7 HepG2细胞活性氧的检测  33    3.3.8 HepG2细胞的划痕擦伤迁移实验  33    3.3.9 统计学分析  33  3.4 实验结果  33-40    3.4.1 rBTI-2抑制肿瘤细胞生长的MTT检测  33-35    3.4.2 煮沸不同时间的rBTI-2抑制肿瘤细胞生长的MTT检测  35-36    3.4.3 倒置显微镜观察HepG2细胞生长的变化  36    3.4.4 细胞核形态学的检测  36-37    3.4.5 几种突变体蛋白抑制HepG2细胞生长的MTT检测  37    3.4.6 HepG2细胞活性氧的检测  37-38    3.4.7 HepG2细胞的划痕擦伤迁移实验  38-40  3.5 讨论  40-42总结与展望  42-44参考文献  44-49攻读学位期间取得的研究成果  49-50致谢  50-51个人简况及联系方式  51-53

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤病理学、病因学
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