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东海海域具潜在应用价值的微生物筛选与鉴定

作　者: 刘双霜
导　师: 张兴群
学　校: 东华大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 海洋微生物 分离纯化 抗菌活性物质 菌种鉴定 非核糖体多肽酶系
分类号: Q938.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


海洋蕴藏着非常丰富的微生物资源,由于海洋环境非常特殊,使得海洋微生物能够产生许多结构新颖的物质,这些物质具有特殊的活性。对海洋微生物资源的调查对今后开发微生物资源具有重要的指导意义。对东海海域东经120。到123。,北纬28。到31。范围内共采集海水样品14个,海底沉积物样品10个。海底沉积物采样深度20m到260m,海水采样深度2m到5m。平板稀释法分离海洋微生物,实验表明培养基的组成和培养条件对海洋微生物的生长及活性物质的产生都有影响。14个海水样品中,共分离出1260株细菌；10个海洋沉积物样品中,共分离出1151株细菌,168株真菌。根据菌落形态特征,将纯培养菌株归隶为19个编号(海水样品)和76个编号(海洋沉积物样品)。利用个体形态,结合生理生化实验和16S rRNA技术对95个编号的细菌进行进一步鉴定和系统发育分析,评估其多样性情况。16S rRNA系统发生学分析表明,海水样品中分离出来的细菌多数为嗜盐单孢菌属(Halomonas)的种类。海洋沉积物样品中分离出来的细菌种类多样性明显,它们分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)(47株),盐单胞菌属(Halomonas)(5株),短杆菌属(Brevibacterium)(3株),希瓦氏菌属(Shewanella)(3株),假单胞菌属(Pseudomonas)(4株),泛生菌属(Pantoea)(1株),迪茨菌属(Dietzia)(1株),动性球菌属(Planococcus)(1株),海洋芽孢杆菌属(Marinibacillus)(2株),Sphingopyxis(1株),Salegentibacter(2株),玫瑰杆菌属(Roseobacter) (3株),Flexibacter(1株),Hoeflea(1株)。其中有47株是属于芽孢杆菌属,占鉴定菌株的62%,据此推测芽孢杆菌属为东海海域海洋沉积物中的优势属。而这47株芽孢杆菌属中又鉴定出14个种,可见东海沉积物中芽孢杆菌的的种类具有多样性和丰富性。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginose)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、白色念珠菌(Candida albicans)作为指示菌,利用琼脂块法和牛津杯法对海水和海洋沉积物样品分离出的95株细菌菌株抗菌性质进行筛选。结果显示,有2株细菌具有明显抗金黄色葡萄球菌活性,1株细菌具有明显抗枯草芽孢杆菌活性。本研究以非核糖体多肽酶系作为研究对象,以NRPSs A结构域保守序列设计简并引物,对分离出的细菌进行了NRPSs的筛选,希望能获得NRPSs基因片段,得到了3株能扩增出NPRS A结构域片段的海洋细菌,为今后开发海洋来源的非核糖体多肽类物质打下基础。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
图形清单  9-10
表格清单  10-11
主要缩略词表  11-15
1 绪论  15-26
  1.1 海洋微生物的多样性  15-17
    1.1.1 海洋微生物的物种多样性  16
    1.1.2 海洋微生物遗传多样性  16-17
    1.1.3 海洋微生物生态系统多样性  17
  1.2 海洋沉积物的生境特点  17-20
    1.2.1 沉积物中的微生物多样性研究  18-20
  1.3 海洋微生物的主要特征及活性物质  20-22
    1.3.1 海洋微生物的主要特征  20-21
    1.3.2 海洋微生物活性物质  21-22
  1.4 海洋微生物研究中的分子生物学技术  22-25
    1.4.1 16S rRNA核酸测序技术  23-24
    1.4.2 聚合酶链式反应技术  24
    1.4.3 遗传指纹图谱技术  24
    1.4.4 限制性酶切片段长度多态性技术  24-25
  1.5 研究背景和主要内容  25-26
    1.5.1 研究背景  25
    1.5.2 实验主要内容  25-26
2 东海微生物的分离纯化及抗菌活性筛选  26-39
  2.1 实验材料  26-33
    2.1.1 采集样品  26-28
    2.1.2 抗菌活性筛选模型菌株  28
    2.1.3 药品与试剂  28-29
    2.1.4 仪器与设备  29-30
    2.1.5 溶液及培养基配方(W/V%)  30-33
  2.2 实验和分析方法  33-34
    2.2.1 微生物的分离纯化  33
    2.2.2 分离培养  33
    2.2.3 菌落形态观察  33
    2.2.4 菌种保存  33
    2.2.5 指示菌株的活化  33-34
    2.2.6 抗菌活性筛选  34
  2.3 结果与讨论  34-37
    2.3.1 不同温度下菌落生长状态  34
    2.3.2 不同培养基对分离效果的影响  34-35
    2.3.3 生物量统计  35
    2.3.4 菌落形态观察  35-36
    2.3.5 抗菌活性筛选结果  36
    2.3.6 实验结果讨论  36-37
  2.4 本章小节  37-39
3 细菌菌种鉴定及系统发育分析  39-60
  3.1 实验材料  39-41
    3.1.1 药品与试剂  39-40
    3.1.3 仪器与设备  40-41
    3.1.4 培养基(W/V%)  41
  3.2 实验和分析方法  41-45
    3.2.1 技术路线  41-42
    3.2.2 形态学观察  42-43
    3.2.3 生理生化鉴定  43
    3.2.4 细菌基因组DNA制备  43
    3.2.5 DNA浓度和纯度估计  43-44
    3.2.6 16S rRNA分子鉴定  44-45
  3.3 结果与讨论  45-59
    3.3.1 染色及生理生化特性  45-46
    3.3.2 DNA的提取和PCR扩增  46-47
    3.3.3 16S rRNA序列测定及系统发育分析  47-58
    3.3.4 实验结果讨论  58-59
  3.4 本章小节  59-60
4 分子生物学方法筛选非核糖体多肽  60-67
  4.1 实验材料  62-63
    4.1.1 药品与试剂  62-63
    4.1.2 仪器与设备  63
  4.2 实验和分析方法  63-64
    4.2.1 细菌基因组DNA制备  63
    4.2.2 DNA浓度和纯度估计  63
    4.2.3 PCR扩增  63-64
  4.3 结果与讨论  64-66
    4.3.1 DNA的提取和PCR扩增  64-65
    4.3.2 实验结果讨论  65-66
  4.4 本章小节  66-67
5 结论与展望  67-69
  5.1 结论  67-68
  5.2 展望  68-69
参考文献  69-75
致谢  75-76
攻读学位期间发表的学位论文  76

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生态学和地区分布 > 水生微生物学
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