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重金属铅对家蚕的抗氧化和生殖发育相关基因表达以及酶活性的影响

作　者: 李艳梅
导　师: 徐世清；袁红霞；司马杨虎
学　校: 苏州大学
专　业: 发育生物学
关键词: 家蚕铅离子解毒酶生殖发育酶活性基因表达活性
分类号: S884.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

铅是一种对人类和小鼠等哺乳类动物以及水生动物存在显著不良影响的重金属,但铅对无脊椎动物、特别是对昆虫的影响鲜有研究报道。zonghe特异蛋白基因只在家蚕是鳞翅目模式昆虫,也是一种应用广泛的实验动物。本实验以幼虫期全龄添食Pb（NO3）2对家蚕进行铅暴露,调查了Pb²⁺在家蚕体内组织的蓄积及其对家蚕生长和生殖发育的影响,重点调查了Pb²⁺暴露后家蚕组织的抗氧化相关基因和生殖发育相关基因的表达和酶活性的变化。主要获得了以下结果:1.铅胁迫家蚕的Pb²⁺蓄积有明显组织和性别差异原子吸收光谱法（GFAAS）测定结果显示,铅暴露后家蚕5龄幼虫的消化吸收组织中肠和马氏管,以及性腺组织中,Pb²⁺含量随着添食Pb（NO3）2浓度的提高而增加,有明显的蓄积效应;蚕粪中Pb²⁺含量也随着添食Pb（NO3）2浓度的提高显著增加,且具有浓度梯度效应。说明铅胁迫家蚕幼虫具有较强的排泄解毒能力,同时铅离子能够在幼虫生殖腺蓄积。在相同暴露浓度时,家蚕5龄雌性幼虫的中肠内Pb²⁺含量高于雄性,但两性中肠内Pb²⁺含量都随着暴露浓度的提高而显著增加。两性5龄幼虫马氏管中的Pb²⁺含量与消化管中接近,但随暴露浓度的提高呈现先升高后降低的趋势,40mg/kg暴露浓度下,雄性幼虫马氏管中Pb²⁺的含量显著高于雌性,提示雄性通过马氏管排泄血液中Pb²⁺能力比雌雄幼虫高。5龄幼虫生殖腺中的Pb²⁺的蓄积量显著低于消化管和马氏管,饲料中Pb²⁺浓度为40-160mg/kg时,雌性生殖腺中Pb²⁺含量均高于雄性,暗示雌性生殖腺可能受到Pb²⁺的影响更大。2.家蚕脂肪体、中肠和生殖腺中抗氧化解毒酶活性及相关基因表达对铅胁迫敏感昆虫受重金属胁迫后,抗氧化解毒酶系成员有通过联合作用来清除铅离子胁迫产生的自由基危害的作用。本实验在10-160mg/kg铅暴露后,家蚕5龄6 d幼虫体内的SOD活性,在脂肪体和中肠组织中上升,而在生殖腺中下降;CAT活性在脂肪体中上升,在中肠和生殖腺中下降。在实验浓度范围内,Sod基因的表达水平在脂肪体、中肠和生殖腺内均出现下降趋势,而Cat基因在3个调查组织中都有不同程度的上调表达,但这2个基因表达水平的变化与各自蛋白酶活性的变化不同步,显示体内SOD和CAT酶活性的升高,不完全依赖基因转录与蛋白质合成。推测铅离子胁迫后,家蚕幼虫脂肪体具有上升抗氧化酶活性解毒;而生殖腺的抗氧化酶活性下降,有氧化受损的可能。谷胱甘肽S-转移酶（GST）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是生物体内重要的解毒酶。正常家蚕5龄6 d幼虫生殖腺中的GST酶活性分别是脂肪体和中肠中的20.0倍、34.6倍,GSH-Px酶活性分别是脂肪体和中肠中的46.6倍和57.5倍。幼虫食下含Pb²⁺ 10 mg/kg以上的人工饲料时,生殖腺中2种解毒酶的活性成倍下降;饲料含Pb²⁺ 20-80 mg/kg时,生殖腺中的Gstd1和Gsh-Px基因mRNA转录水平也显著下调,且雄性比雌性更加显著。幼虫食下含Pb²⁺ 10-160 mg/kg的人工饲料时,脂肪体中2种解毒酶活性显著升高,Pb²⁺对2种酶的影响浓度分别为10-160 mg/kg和20-80 mg/kg,但在20-80 mg/kg Pb²⁺范围内,Gsh-Px和Gstd1基因mRNA的转录却受到抑制,并且雌性幼虫脂肪体中的GSH-Px酶活性及基因mRNA转录水平、雄性幼虫脂肪体中的GST酶活性及其基因mRNA转录水平对Pb²⁺暴露更加敏感。幼虫食下含Pb²⁺ 20 mg/kg以上的人工饲料时,中肠GST酶活性显著上升,而GSH-Px酶活性变化较小,性别间差异不明显;Gstd1基因mRNA转录水平有上调趋势,Gsh-Px基因mRNA转录水平则受到显著抑制。结果显示,家蚕幼虫生殖腺虽然有比脂肪体和中肠更强的GST酶和GSH-Px活性,但对Pb²⁺的毒害敏感,雄性比雌性受影响更大,生殖腺通过抗氧化防御系统抵御Pb²⁺毒害的作用很弱。3.铅胁迫对家蚕卵黄蛋白原基因和卵特异蛋白基因表达有显著影响家蚕卵黄蛋白原基因Vg与卵特异蛋白基因Esp是家蚕的2个生殖发育相关的重要基因。EST电子表达谱结果显示,家蚕Vg只在吐丝期和蛹期脂肪体与卵巢组织中表达,家蚕Esp只在蛹期卵巢中表达。为了解重金属铅是否存在环境雌激素效应,本文实验调查了铅暴露后,Vg和Esp基因在其特异时空的表达谱。结果表明,在20-160 mg/kg Pb²⁺暴露浓度范围内,家蚕5龄雌性幼虫脂肪体Vg基因的表达量较未接触铅离子的对照蚕呈下降趋势;20 mg/kg Pb²⁺低暴露浓度下,家蚕雄性5龄幼虫脂肪体中Vg基因的表达量为对照的1.15倍,出现了Vg基因的微弱诱导表达,但Pb²⁺暴露浓度提高到40-160 mg/kg时,雄蚕脂肪体中Vg基因的表达量比对照显著降低。幼虫期正常两性家蚕生殖腺中都有Vg基因的微弱表达,其中雌性的表达水平显著高于对照。在20 mg/kg组雄性生殖腺中Vg基因的表达水平较对照显著升高,和幼虫脂肪体中的结果一致,暗示该铅暴露浓度有诱导雄性Vg基因表达的环境雌激素效应可能。家蚕蛹期脂肪体中Vg基因的转录活性显著高于幼虫期,而且蛹期有显著的性别差异,雄蛹脂肪体中Vg基因的表达量仅为雌性的3.59%。20-160 mg/kg Pb²⁺暴露后,家蚕雄蛹脂肪体中Vg基因转录水平显著下调（P<0.01）,而雌蛹脂肪体中Vg基因的表达量显著上调（P<0.01）,但其中20 mg/kg组显著下降（P<0.01）。蛹期生殖腺中Vg基因的表达量性别差异小于幼虫期;铅离子暴露后,3d龄蚕蛹卵巢中Vg表达水平显著下降,而睾丸中Vg表达水平在低水平波动,但160 mg/kg浓度组出现显著下调。家蚕幼虫期与蛹期Vg基因的转录受铅离子暴露影响方式可能不同。家蚕蛹期生殖腺中Esp基因mRNA水平调查结果显示,实验浓度范围内铅离子胁迫,造成了雌性生殖腺中Esp基因表达的显著下调,但没有诱导雄性家蚕生殖腺中Esp基因表达。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-13
第一章文献综述  13-32
  1 铅污染来源及对生物的影响  13-18
    1.1 重金属铅污染的来源  13-14
    1.2 铅对生物的影响  14-18
  2 氧化损伤应激相关基因  18-27
    2.1 超氧化物歧化酶  20-22
    2.2 过氧化氢酶  22-24
    2.3 谷胱甘肽硫转移酶  24-26
    2.4 谷胱甘肽过氧化物酶  26-27
  3 家蚕生殖相关基因  27-32
    3.1 卵黄蛋白原基因  28-31
    3.2 卵特异蛋白基因  31-32
第二章原子吸收光谱石墨炉法测定家蚕组织中的铅离子含量  32-39
  1 材料和方法  32-33
    1.1 供试家蚕品种  32
    1.2 主要仪器设备和试剂  32
    1.3 家蚕铅暴露与取材方法  32-33
    1.4 P6~(2+)含量测定  33
  2 结果与分析  33-37
    2.1 P6~(~(2+)) 在家蚕雌雄中肠组织中的分布差异  33-35
    2.2 P6~(2+) 在家蚕雌雄马氏管组织中的分布差异  35-36
    2.3 P6~(2+) 在家蚕蚕粪中的分布  36
    2.4 P6~(2+) 在家蚕雌雄生殖腺组织中的分布差异  36-37
  3 结论与讨论  37-39
第三章铅对家蚕组织氧化相关酶活性以及基因表达的影响  39-68
  1 材料和方法  39-44
    1.1 供试家蚕品种  39
    1.2 家蚕处理与取材方法  39-40
    1.3 家蚕基本生长发育指标的调查  40
    1.4 组织酶活性测定  40-43
    1.5 实时荧光定量PCR 测定组织抗氧化酶相关基因表达  43-44
    1.6 数据处理  44
  2 结果与分析  44-64
    2.1 铅暴露家蚕的生长发育  44-47
    2.2 铅暴露家蚕的生命力  47-49
    2.3 铅暴露后家蚕幼虫不同组织SOD 酶活性及其基因表达的变化  49-52
    2.4 铅暴露后家蚕幼虫不同组织CAT 酶活性及其基因表达的变化  52-55
    2.5 铅暴露后家蚕幼虫不同组织GST 酶活性以Gstd1 基因表达的变化  55-60
    2.6 铅暴露后家蚕幼虫不同组织GSH-Px 酶活性及其基因表达的变化  60-64
  3 结论与讨论  64-68
    3.1 铅胁迫下家蚕幼虫组织的SOD 和CAT 酶系的反应机制  64-66
    3.2 家蚕抗氧化防御系统的GST 和GSH-Px 酶活性对铅离子暴露敏感  66-67
    3.3 家蚕抗氧化防御系统的GST 和GSH-Px 酶活性上升调控机制  67-68
第四章铅离子暴露对家蚕生殖发育相关基因表达的影响  68-79
  1 材料和方法  68-69
    1.1 供试家蚕品种  68
    1.2 家蚕处理与取材方法  68
    1.3 基因转录水平调查方法  68-69
  2 结果与分析  69-77
    2.1 铅胁迫对家蚕后代卵孵化率的影响  69
    2.2 铅胁迫对家蚕Vg 基因表达的影响  69-76
    2.3 铅暴露对家蚕卵特异蛋白基因表达的影响  76-77
  3 结论与讨论  77-79
第五章综合结论  79-82
参考文献  82-97
研究生期间发表文章  97-98
论文资助项目  98-99
附录  99-101
致谢  101-102

重金属铅对家蚕的抗氧化和生殖发育相关基因表达以及酶活性的影响

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