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NBEAL1基因与蛋白功能的初步研究

作　者: 鲍晨晨
导　师: 崔大祥
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: NBEAL1(Neurobeachin Like 1) 基因克隆表达纯化抗体制备脑胶质瘤病理分级
分类号: R739.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:构建新基因Neurobeachin Like 1(NBEAL1)的表达载体,表达纯化重组蛋白并鉴定其生物活性,制备单克隆抗体并检测NBEAL1蛋白在不同恶性程度脑胶质瘤中的表达情况。方法:通过先提取正常人脑组织的总RNA,反转录得到cDNA,筛选合适的片段构建pGEX-KG/NBEAL1表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,GST蛋白亲和纯化,Western Blotting鉴定纯化产物的纯度和特异性,制备单克隆抗体,并用所制备的抗体研究该蛋白在肿瘤恶性程度变化中的作用。结果: NBEAL1基因片段被克隆入pGEX-KG表达载体,测序证实克隆片段序列正确,NBEAL1融合蛋白在包涵体中表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化的重组蛋白纯度达95%以上。Western Blotting证明所纯化的蛋白含有GST标签与NBEAL1肽段。2株单克隆抗体被成功制备。该蛋白在正常脑组织中表达较低,而在低级别的脑胶质瘤组织中表达明显上调,并且恶性程度越高,NBEAL1的表达程度越低,两者呈负相关。结论:NBEAL1基因片段被成功克隆、表达及纯化;它的单克隆抗体被成功制备;它在脑胶质瘤中的表达量与胶质瘤的恶性程度具有相关性。本研究为进一步阐明NBEAL1基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用奠定了基础。

全文目录

摘要  2-3
ABSTRACT  3-8
1 前言  8-23
  1.1 NBEAL1 基因的研究进展  8-9
  1.2 BEACH 蛋白家族成员介绍  9-14
    1.2.1 BEACH 蛋白家族的发现  9-10
    1.2.2 BEACH 蛋白的结构  10-11
    1.2.3 BEACH 蛋白家族代表成员及其功能  11-14
  1.3 脑胶质瘤研究概述  14-22
    1.3.1 恶性脑胶质瘤的种类  14-15
    1.3.2 脑胶质瘤细胞的发病机理  15-19
    1.3.3 恶性脑胶质瘤诊断相关分子靶标  19-22
  1.4 本论文的主要研究工作  22-23
2 NBEAL1 基因表达载体的构建  23-37
  2.1 材料与方法  23-24
    2.1.1 设备  23
    2.1.2 主要试剂及配方  23-24
    2.1.3 病例资料和病理标本  24
  2.2 实验部分  24-34
    2.2.1 序列分析与引物设计  24-28
    2.2.2 总RNA 的提取  28
    2.2.3 反转录获得cDNA 片段  28-29
    2.2.4 pGEX-KG-NBEAL 重组质粒的构建  29-32
    2.2.5 重组子转化和筛选  32-33
    2.2.6 重组子的PCR 鉴定和酶切鉴定  33-34
  2.3 实验结果  34-35
    2.3.1 PCR 鉴定结果  34-35
    2.3.2 质粒酶切验证  35
  2.4 实验讨论  35-37
3 NBEAL1 的表达纯化以及单克隆抗体的制备  37-50
  3.1 材料与方法  37-40
    3.1.1 仪器设备  37
    3.1.2 试剂  37-38
    3.1.3 配方  38-40
  3.2 实验部分  40-46
    3.2.1 NBEAL1 的诱导表达  40
    3.2.2 SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白的表达  40-43
    3.2.3 NBEAL1 的纯化  43-44
    3.2.4 单克隆抗体的制备与NBEAL1 的鉴定  44-45
    3.2.5 Western-Blot 检测NBEAL1 蛋白活性情况  45-46
    3.2.6 单克隆抗体的筛选与鉴定  46
  3.3 实验结果  46-48
    3.3.1 SDS-PAGE 检测NBEAL1 片段在大肠杆菌中的表达与纯化的结果  46-48
    3.3.2 Western-Blotting 检测NBEAL1 在大肠杆菌中的融合表达  48
  3.4 单克隆抗体的筛选与鉴定  48-49
  3.5 实验讨论  49-50
4 免疫组化检测人脑胶质瘤组织中NBEAL1 的表达  50-56
  4.1 材料与方法  51-52
    4.1.1 病理材料  51
    4.1.2 实验设备  51
    4.1.3 试剂  51
    4.1.4 配方  51-52
  4.2 实验部分  52-53
    4.2.1 组织标本取材、固定和切片  52
    4.2.2 免疫组织化学染色步骤  52-53
    4.2.3 结果判断  53
    4.2.4 统计学处理  53
  4.3 实验结果  53-55
    4.3.1 免疫组化检测人脑胶质瘤组织中NBEAL1 的表达  53-54
    4.3.2 对于免疫组化后结果的统计学分析  54-55
  4.4 实验讨论  55-56
5 全文总结与展望  56-57
6 全文参考文献  57-64
致谢  64-66
攻读学位期间发表的学术论文  66-68

NBEAL1基因与蛋白功能的初步研究

内容摘要

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