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Arthrobacter nitroguajacolicus腈水解酶基因的克隆与表达

作　者: 唐璐敏
导　师: 许建和；薛建萍
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物工程
关键词: 腈水解酶 基因克隆 重组菌 培养优化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本文从菌株Arthrobacter nitroguajacolicus中克隆了腈水解酶基因,并构建了一株具有腈水解酶活性的重组大肠杆菌E. coli BL21(DE3)-pETNYNitd。优化培养条件后,此重组菌的发酵酶活单位明显高于野生菌,最高达野生菌的3倍。重组菌发酵生产周期缩短至野生菌的一半,发酵酶活单位最高达野生菌的3倍,其生产电耗计算值比野生菌降低60%，酶生产率比野生菌提高300%，具备工业生产的潜力。主要研究内容和结果如下：1、通过酶分离纯化、基因文库筛选、侧翼序列扩增等步骤获得了Arthrobacter nitroguajacolicus菌的腈水解酶基因,命名为NYNit。构建了重组质粒pETNYNit,导入宿主E. coli BL21(DE3)构建了重组菌E. coli BL21(DE3)-pETNYNit。2、从两种途径入手提高重组菌E. coli BL21(DE3)-pETNYNit的发酵酶活单位。途径一：通过诱导条件的优化,重组菌的发酵酶活水平达野生菌的1/3：途径二：应用三轮正交试验对发酵培养基进行优化,在此基础上再进行种龄优化.优化后重组菌的酶活单位与野生菌酶活单位相近。3、将重组质粒pETNYNit中腈水解酶基因前表达Tag蛋白的DNA切除,构建了重组质粒pETNYNitd,转入宿主E. coli BL21(DE3)得到重组大肠杆菌E. coli BL21(DE3)-pETNYNitd.在相同的培养条件下,E. coli BL21(DE3)-pETNYNitd的发酵酶活单位比E. coli BL21(DE3)-pETNYNit显著提升,前者是后者的2倍。4、在重组菌E. coli BL21(DE3)-pETNYNitd的培养过程中,以乳糖取代IPTG诱导酶的表达可以达到并优于IPTG的诱导效果,其发酵酶活单位最高达野生菌的3倍。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
第1章 前言  10-16
  1.1 氰基水解酶的分类  10
  1.2 腈水解酶的来源  10-13
  1.3 腈水解酶的结构  13
  1.4 腈水解酶的应用价值  13-14
  1.5 腈水解酶的研究状况  14-15
    1.5.1 国外研究状况  14-15
    1.5.2 国内研究状况  15
    1.5.3 我单位腈水解酶应用现状及开题意义  15
  1.6 本章小结  15-16
第2章 Arthrobacter nitroguajacolicus腈水解酶基因的克隆  16-40
  2.1 引言  16
  2.2 实验方法  16-22
    2.2.1 主要分析方法  16-17
      2.2.1.1 酶活的测定  16
      2.2.1.2 蛋白质的测定  16
      2.2.1.3 OD_(600)值测定  16
      2.2.1.4 蛋白质测序  16
      2.2.1.5 引物合成及DNA测序  16-17
    2.2.2 Arthrobacter nitroguajacolicus菌的培养  17
    2.2.3 大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)的培养  17
    2.2.4 主要实验技术  17-20
      2.2.4.1 细菌基因组的提取  17
      2.2.4.2 琼脂糖凝胶电泳  17
      2.2.4.3 DNA电泳凝胶回收  17-18
      2.2.4.4 大肠杆菌感受态制备及转化  18
      2.2.4.5 从大肠杆菌中提取质粒  18-19
      2.2.4.6 SDS-PAGE蛋白质电泳  19-20
    2.2.5 基因的克隆  20-21
      2.2.5.1 酶的分离纯化  20
      2.2.5.2 克隆方法  20-21
    2.2.6 基因的表达  21-22
  2.3 结果与讨论  22-38
    2.3.1 酶的分离纯化  22-29
      2.3.1.1 酶的稳定性  22-24
      2.3.1.2 酶的分子量  24-25
      2.3.1.3 粗酶液的获得  25
      2.3.1.4 酶的柱层析  25-28
      2.3.1.5 N端蛋白质序列分析  28-29
    2.3.2 基因的克隆  29-37
      2.3.2.1 基因文库的构建及筛选  29-31
      2.3.2.2 目标基因的获得  31-34
      2.3.2.3 NYNitp序列初步分析  34-37
    2.3.3 基因的表达  37-38
  2.4 本章小结  38-40
第3章 重组菌E. coli BL21(DE3)-pETNYNit诱导条件及培养优化  40-58
  3.1 引言  40
  3.2 实验方法  40-42
    3.2.1 主要分析方法  40
      3.2.1.1 酶活的测定  40
      3.2.1.2 OD_(600)值测定  40
    3.2.2 重组菌诱导条件优化  40-41
      3.2.2.1 重组菌发酵培养生长曲线  40-41
      3.2.2.2 重组菌诱导因素实验  41
    3.2.3 重组菌发酵培养基优化  41
    3.2.4 重组菌种龄实验  41-42
  3.3 结果和讨论  42-56
    3.3.1 重组菌诱导表达条件的优化  42-44
    3.3.2 重组菌发酵培养基优化  44-55
      3.3.2.1 发酵培养基优化实验  44-48
      3.3.2.2 发酵培养基优化实验二  48-52
      3.3.2.3 发酵培养基优化实验三  52-55
      3.3.2.4 水质实验  55
    3.3.3 种龄实验  55-56
  3.4 本章小结  56-58
第4章 重组菌E.coli BL21(DE3)-pETNYNit~d的构建  58-62
  4.1 引言  58
  4.2 实验方法  58-59
    4.2.1 主要分析方法  58
      4.2.1.1 酶活的测定  58
      4.2.1.2 OD_(600)值测定  58
    4.2.2 质粒pETNYNit~d的构建  58-59
    4.2.3 两株重组菌的比较  59
  4.3 结果与讨论  59-61
    4.3.1 质粒pETNYNit~d的构建  59
    4.3.2 两株重组菌的比较  59-61
  4.4 本章小结  61-62
第5章 重组菌E. coli BL21(DE3)-pETNYNit~d的乳糖诱导表达  62-66
  5.1 引言  62
  5.2 实验方法  62-63
    5.2.1 主要分析方法  62
      5.2.1.1 酶活的测定  62
      5.2.1.2 OD_(600)值测定  62
    5.2.2 培养条件调整  62-63
    5.2.3 乳糖诱导浓度考察  63
  5.3 结果与讨论  63-64
    5.3.1 培养条件调整  63-64
    5.3.2 乳糖诱导浓度考察  64
  5.4 本章小结  64-66
第6章 结论与展望  66-70
  6.1 全文总结  66-68
    6.1.1 Arthrobacter nitroguajacolicus腈水解酶基因的克隆  66
    6.1.2 重组菌E.coli BL21(DE3)-pETNYNit的构建  66
    6.1.3 重组菌E.coli BL21(DE3)-pETNYNit的培养优化  66-67
      6.1.3.1 诱导条件优化  66-67
      6.1.3.2 发酵培养基优化  67
    6.1.4 重组菌E.coli BL21(DE3)-pETNYNit~d的构建  67
    6.1.5 乳糖取代IPTG诱导表达  67-68
  6.2 结论与创新点  68-69
  6.3 展望  69-70
参考文献  70-73
致谢  73-74
附录一  74-77
附录二  77-79
卷内备考表  79-80

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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