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水稻无孢子生殖相关基因的研究

作　者: 赵心爱
导　师: 薛庆中；John Bennett
学　校: 浙江大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 富亮氨酸重复受体激酶配体 RNA原位杂交酵母双杂交双分子荧光互补分析 RNA干扰双向电泳腈水解酶基因基因表达
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

从简化种子生产程序考虑，今后杂交水稻育种的策略将沿三系法、两系法和一系法三个阶段发展(袁隆平，1988)。其中，所谓一系法便是借助无融合生殖途径固定杂种优势。无孢子生殖是普遍存在于草类植物的一种无融合生殖方式，其特征是：大孢子母细胞正常并发育成单倍体胚囊，其周围的二倍体珠心细胞发育成大小与大孢子母细胞相近的无孢子生殖起始细胞，这些细胞不经过减数分裂直接发育成二倍体胚囊，从而实现无孢子生殖。但在水稻中尚未发现这一生殖现象。敲除多胞囊基因(MULTIPLESPOROCYTES，MSP1)的水稻突变体msp1，在胚珠中虽能产生多个大孢子母细胞，然而其花粉囊绒毡层不发育，只形成额外小孢子母细胞，结果表现雄性不育，不能繁种。针对这一问题，本论文研究了与无孢子生殖特性相关的水稻基因，探索了人工合成水稻无孢子生殖的材料和方法，试图为实现固定水稻杂种优势提供一条重要的途径。主要研究结果包括：1．通过tBLASTn搜索水稻数据库，作者在日本晴(O. sativa. subsp. japonica. cv. Nipponbare)基因组中发现2个绒毡层决定基因(TAPETUM DETERMINANT1，TPD1)OsTDL1A和OsTDL1B，它们与拟南芥TPD1同源。RT-PCR结果显示，在幼穗中OsTDL1A和OsTDL1B与MSP1基因共表达。RNA原位杂交表明，这些基因的表达部位有差异。OsTDL1A和MSP1在大孢子母细胞周围的珠心细胞和小孢子母细胞周围的花粉囊囊壁细胞中均表达，而OsTDL1B仅在花粉囊囊壁细胞中表达，胚珠组织中并不表达。同时基于酵母双杂交和双分子荧光互补分析显示了这两个基因编码蛋白功能上的差异。OsTDL1A编码蛋白能与MSP1基因编码的富亮氨酸重复区域互作，而OsTDL1B却不能。通过RNA干扰技术抑制转化株OsTDL1A基因的转录水平，结果引发多个大孢子母细胞出现，而花粉囊仍然保持正常，由此推测，胚珠内的大孢子母细胞数目受MSP1与配体OsTDL1A的基因互作控制。基于上述实验，作者认为，应用RNA干扰技术产生的水稻OsTDL1A-RNA干扰系将成为人工合成水稻无孢子生殖的重要材料。2．通过ClaustalW多序列比对，发现栽培稻和不同基因组野生稻MSP1基因非编码区序列具有高度的保守性，通过聚类分析可将供试的6个基因组野生稻分成2群。其中AA基因组3个种为一群，它们间的序列同源性高达97.7％。另一群中CC、CCDD、EE基因组间的序列同源性为98％，它们与BBCC的亲缘关系比GG更近；这为研究水稻不同基因组的进化提供了线索。通过转录分析纠正了NCBI对MSP1上游基因注释的错误，其实这是MSP1的5′非翻译区，MSP1转录起始位点应位于Nonomura等(2003)克隆的全长cDNA序列转录起始位点上游2281bp。进一步应用双向电泳和质谱分析研究其编码蛋白的分离及其表达，结果发现在水稻大孢子母细胞时期(3mm幼穗)，日本晴(野生型)和msp1突变体间，共显示9个差异蛋白。与野生型相比，突变体中P1的分了量降低，P2的等电点升高，出现了日本晴中未显示的P3蛋白，P4、P5、P6表达量下调，而P7、P8、P9上调。作者推测MSP1激酶域作为负调节物，可能导致下游冷激蛋白的磷酸化，而抑制信号传导。3．首次发现水稻基因组中存在2个腈水解酶基因(OsNITA和OsNITB)，它们成簇分布在2号染色体上，与拟南芥NIT4基因聚为一类。OsNITA和玉米ZmNIT2的同源性(92％)高于OsNITB和ZmNIT1的同源性(81％)。通过RT-PCR显示，2个水稻腈水解酶基因能在根、茎、叶及幼穗等多种组织中表达，但在表达量上有差异，OsNITA明显高于OsNITB。利用RNA原位杂交技术检测了两基因在水稻根尖(种子萌发后10d)和幼穗(大孢子母细胞时期)中的表达部位。结果表明，OsNITA在根尖分生组织区有较强的杂交信号，而在根冠和伸长区不表达，OsNITB的表达模式与OsNITA相似，但信号很弱。OsNITA在胚珠内的珠心细胞中表达，而在大孢子母细胞内未检测到杂交信号。在花粉囊的表达主要集中于内层、中层和绒毡层，维管细胞中少量表达，小孢子母细胞中则不表达，OsNITB在3mm幼穗中未检测到任何信号。根据水稻腈水解酶基因的结构及时空表达特征，我们推测该基因可能参与催化生长素合成。

全文目录

中文摘要  9-12
英文摘要  12-15
第1章植物无融合生殖研究进展  15-47
  1.1 什么是无融合生殖?  15
  1.2 无融合生殖现象的普遍性  15-17
  1.3 无融合生殖的分类  17-18
  1.4 无融合生殖在农业生产上潜在的应用价值  18-21
  1.5 无融合生殖性状的研究方法  21-22
  1.6 绿毛山柳菊属植物,无孢子生殖和自发配子体单性生殖的模式植物  22-23
  1.7 兼性无融合生殖植物的不同后代类型  23-25
  1.8 无融合生殖植物细胞类型同一性的早期线索  25-26
  1.9 有性生殖和无融合生殖途径间的分子学联系  26-29
  1.10 来自胚珠其它组织的信号  29-30
  1.11 无融合生殖现象的遗传学基础  30-33
  1.12 为什么配子体无融合生殖植物都是多倍体?  33-35
  1.13 无融合生殖基因的识别  35-37
  1.14 诱导无融合生殖突变体策略  37-38
  1.15 作物中导入无融合生殖性状的发展前景  38
  参考文献(Reference):  38-47
第2章 MSP1编码蛋白配体的识别、时空表达及功能研究  47-87
  2.1 前言  47-49
  2.2 材料与方法  49-58
    2.2.1 材料的种植和取样  49-50
    2.2.2 显微镜操作  50
    2.2.3 BLAST和系统进化树的构建  50
    2.2.4 RNA提取、RT-PCR和离体转录  50-52
    2.2.5 RNA原位杂交  52-53
    2.2.6 酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补分析(BiFC)  53-55
      2.2.6.1 入门载体的构建  53
      2.2.6.2 酵母双杂交  53-54
      2.2.6.3 双分子荧光互补分析(BiFC)  54-55
    2.2.7 水稻OsTDL1A基因的RNA干扰  55-58
      2.2.7.1 RNA干扰载体的构建  55-56
      2.2.7.2 农杆菌介导的水稻遗传转化  56-57
      2.2.7.3 RNA干扰材料的筛选  57-58
  2.3 结果  58-74
    2.3.1 水稻中存在着两个拟南芥TPD1同源基因:OsTDL1A和OsTDL1B  58-60
    2.3.2 OsTDL1A,OsTDL1B同MSP1在部分组织中共表达  60-63
    2.3.3 MSP1,OsTDL1A和OsTDL1B在幼穗中的转录部位研究  63-65
    2.3.4 OsTDL1A与MSP1富亮氨酸重复区域存在直接的互作关系  65-68
      2.3.4.1 亚细胞定位的预测  65-66
      2.3.4.2 酵母双杂交分析  66-67
      2.3.4.3 洋葱表皮细胞内的双分子荧光互补分析  67-68
    2.3.5 RNA干扰抑制OsTDL1A在幼穗中的转录水平  68-71
      2.3.5.1 OsTDL1A RNA干扰载体的构建  68-69
      2.3.5.2 RNA干扰植株的分子生物学检测  69-71
    2.3.6 OsTDL1A RNAi植株胚珠内产生与msp1突变体相同的表现型  71-74
  2.4 讨论  74-79
    2.4.1 大孢子母细胞和无孢子生殖起始细胞的比较  74-75
    2.4.2 OsTDL1A干扰植株能恢复雄性可育  75
    2.4.3 MSL1基因的识别  75-76
    2.4.4 OsTDL1A同MSP1基因富亮氨酸重复区域在植物体内互作  76-77
    2.4.5 水稻无孢子生殖的诱导  77-79
  附加信息  79-82
  参考文献(Reference)  82-87
第3章 MSP1基因起始密码子上游序列及其激酶域调控功能的研究  87-109
  3.1 引言  87-88
  3.2 材料与方法  88-93
    3.2.1 小量基因组DNA的提取  88-89
      3.2.1.1 化学试剂的准备  88
      3.2.1.2 小量基因组DNA的提取  88-89
    3.2.2 日本晴和7个野生稻MSP1基因启动子的克隆  89
    3.2.3 Southern杂交  89-90
    3.2.4 MSP1转录起始位点的识别  90
    3.2.5 双向电泳  90-93
      3.2.5.1 总蛋白质的提取  90-91
      3.2.5.2 第一向和第二向电泳  91-92
      3.2.5.3 胶的染色  92
      3.2.5.4 蛋白质的定量与定性分析  92-93
  3.3 结果  93-103
    3.3.1 聚合酶链式反应(PCR)扩增假定的启动子区域  93-95
    3.3.2 MSP1假定启动子区域的克隆及Southern杂交验证  95-97
    3.3.3 不同基因组野生稻MSP1假定启动子区域的序列比较分析  97-98
    3.3.4 MSP1上游基因转录起始位点的确定  98-101
    3.3.5 MSP1纯合突变体及野生型的蛋白表达分析  101-103
  3.4 讨论  103-107
    3.4.1 不同基因组野生稻msp1启动子区域的进化  103-104
    3.4.2 MSP1基因结构的预测  104-106
    3.4.3 野生型和突变体蛋白表达的差异  106-107
  参考文献(Reference)  107-109
第4章水稻腈水解酶基因的识别、表达和细胞学定位  109-122
  4.1 引言  109-110
  4.2 材料与方法  110-111
    4.2.1 材料  110
    4.2.2 BLAST搜索和DNA序列鉴定  110
    4.2.3 系统进化树的构建和基因结构画图  110
    4.2.4 RNA提取和RT-PCR  110-111
  4.3 结果  111-117
    4.3.1 水稻腈水解酶基因的识别  111-112
    4.3.2 水稻腈水解酶基因的结构分析  112-114
    4.3.3 水稻腈水解酶基因的表达分析  114-115
    4.3.4 水稻腈水解酶基因mRNA的细胞学定位:RNA原位杂交  115-117
  4.4 讨论  117-119
  参考文献(References):  119-122
附录A插图目录  122-124
附录B插图目录  124

水稻无孢子生殖相关基因的研究

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