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碱性纤维素酶产生菌的筛选、酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达研究

作　者: 周晓静
导　师: 刘相梅
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 碱性纤维素酶菌种筛选产酶优化基因克隆表达酶分离纯化酶学性质
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

纤维素资源和纤维素酶是各国研究的热点领域,其中细菌产的碱性纤维素酶是研究的一个重要方面,碱性纤维素酶在洗涤、纺织、造纸、环保等行业都具有广阔的应用前景。本文从碱性土样中,筛选获得20余株碱性纤维素酶产生菌株,经摇瓶复筛,得到一株酶活最高的嗜碱细菌Z-16。经16S rDNA序列比对和生理生化特征检测,初步鉴定Z-16属于芽孢杆菌属（Bacillus）。对粗酶液性质研究表明：Bacillussp.Z-16所产纤维素酶最适作用pH 7.0-7.5,在pH 6.5-9.0的范围有80%以上酶活,最适作用温度为50℃；该酶具有良好的pH和温度稳定性,在pH 3-10的条件下保存2h后,粗酶液仍能保持90%以上的酶活；Na+、K+和Mn2+对酶有明显的激活作用,Co2+、Hg2+、Cd2+和SDS抑制酶的活性,Zn2+和Cu2+使酶完全失活,而EDTA、Triton X-100和Tween 20对酶活无显著影响。对Bacillus sp. Z-16的摇瓶产酶条件进行优化,最佳产酶条件为：碳源为CMC-Na,氮源为酵母粉,初始培养pH 9.0,培养基装液量10%,接种量3%,培养温度30℃,摇床转速120rpm,培养36 h。优化后,Bacillus sp. Z-16的纤维素酶酶活可达3.48 U／mL,是优化前的7.5倍。通过对已发表的同源纤维素酶序列进行分析,设计引物,以Bacillus sp. Z-16基因组为模板,扩增得到含Z-16纤维素酶基因的DNA片段,经克隆测序,结果表明该酶基因ORF长2475 bp,编码824个氨基酸。对演推的蛋白序列分析表明,该酶N-端有30个氨基酸的信号肽,催化结构域属于糖苷水解酶第5家族,C端为CBM₁7₂8家族的纤维结合结构域。该酶去除信号肽的成熟酶计算分子量88,181 Da, pI值为4.19。该酶的催化结构域与日本投入应用的洗涤用碱性纤维素酶Cel K有72%的同源性。将Z-16纤维素酶去除信号肽的全酶基因（gen 2）和催化结构域部分基因（gen3）分别克隆至pET-28a（+）表达载体,在E.coli BL21 （DE3）中进行高效表达。对重组酶Cel 2和Cel 3的胞外表达条件进行了优化,当培养液菌浓A600达到0.8时,加入0.8 mM的IPTG,37℃诱导16h后,Cel 2和Cel 3胞外酶活达到最高,分别为1.191 U／mL和9.307 U／mL,此时它们胞外比活分别为17.80 U／mg和45.13U／mg。重组酶Cel 2和Cel 3的胞外粗酶液经超滤浓缩处理后,进行His6标签一步亲和层析,得到纯化的重组酶Cel 2和Cel 3,纯化倍数分别为3.2和2.5倍,比活分别达到63.5 U／mg和89.0 U／mg。随后对两种纯酶的酶学性质研究表明：重组全酶Cel 2的最适作用pH为7.5,在7.5-9.0的pH范围有90%以上酶活,最适温度50℃,均表现与粗酶液一致的特性；重组催化域Cel 3的最适作用pH为7.5,在6.5-8.0的pH范围有90%以上酶活,较Cel 2偏酸了一个pH单位,而Cel 3的最适作用温度提高至55-60℃；金属离子、EDTA及表面活性剂对Cel 2和Cel3的影响,均与对粗酶液的影响基本一致。此外,还测定了纯酶的Km和Vmax,Cel 2和Cel 3分别为0.105 mmol/L和0.900 mmol/L,0.05 mmol/L/min和0.280mmol/L/min。综上所述,本研究首先通过筛选获得一个产pH和温度稳定性良好的碱性纤维素酶的嗜碱芽孢杆菌,对其产酶条件进行了优化,随后克隆了纤维素酶基因,实现了酶基因的异源表达,纯化了重组酶并研究了酶学特性,为研究碱性纤维素酶耐碱机理提供了材料,为实现碱性纤维素酶在工业领域的应用奠定了基础。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-14
第一章绪论  14-25
  1.1 产纤维素酶微生物的选育  14-19
    1.1.1 纤维素酶的筛选策略  14-17
    1.1.2 产纤维素酶细菌的主要类群  17-19
  1.2 细菌纤维素酶的分子生物学研究  19-22
    1.2.1 细菌纤维素酶的组分和结构  19
    1.2.2 细菌纤维素酶的基因克隆和表达  19-20
    1.2.3 细菌纤维素酶的体外改造  20-22
  1.3 纤维素酶的应用前景  22-24
    1.3.1 在纤维乙醇中的应用  22
    1.3.2 在洗涤剂行业的应用  22-23
    1.3.3 在造纸行业的应用  23
    1.3.4 在纺织行业的应用  23-24
  1.4 本文的研究目的及内容  24-25
第二章产碱性纤维素酶细菌的筛选鉴定及其粗酶液的酶学性质  25-37
  2.1 导言  25
  2.2 材料与方法  25-28
    2.2.1 土样来源  25
    2.2.2 菌株与质粒  25
    2.2.3 培养基  25-26
    2.2.4 菌种筛选方法  26
    2.2.5 纤维素酶酶活的测定  26-27
    2.2.6 菌种鉴定  27-28
  2.3 结果与讨论  28-35
    2.3.1 菌种的分离  28-29
    2.3.2 菌株Z-16的鉴定  29-32
    2.3.3 菌株Z-16粗酶液的酶学性质  32-35
  2.4 小结  35-37
第三章芽孢杆菌Z-16产碱性纤维素酶的条件优化  37-45
  3.1 导言  37
  3.2 材料与方法  37-38
    3.2.1 菌种  37
    3.2.2 培养基  37
    3.2.3 摇瓶发酵优化方法  37
    3.2.4 纤维素酶酶活测定  37
    3.2.5 菌体生长的测定  37
    3.2.6 蛋白质浓度的测定  37-38
  3.3 结果与讨论  38-44
    3.3.1 培养基中碳源对产酶的影响  38-39
    3.3.2 培养基中氮源对产酶的影响  39
    3.3.3 碳、氮源浓度对产酶的影响  39-40
    3.3.4 NaCl浓度对产酶的影响  40-41
    3.3.5 初始pH值对产酶的影响  41
    3.3.6 培养温度对产酶的影响  41-42
    3.3.7 摇床转速对产酶的影响  42-43
    3.3.8 接种量对产酶的影响  43
    3.3.9 摇瓶装液量对产酶的影响  43-44
  3.4 小结  44-45
第四章芽孢杆菌Z-16纤维素酶的基因克隆及表达研究  45-58
  4.1 导言  45
  4.2 材料与方法  45-52
    4.2.1 菌株与质粒  45
    4.2.2 工具酶与生化试剂  45-46
    4.2.3 培养基  46
    4.2.4 Bacillus sp.Z-16所产纤维素酶基因的克隆  46-50
    4.2.5 纤维素酶基因gen2和gen3在E.coli BL21(DE3)中的高效表达  50-51
    4.2.6 纤维素酶酶活的测定  51-52
  4.3 结果与讨论  52-56
    4.3.1 纤维素酶基因的克隆及序列分析  52-53
    4.3.2 纤维素酶基因gen2和gen3在E.coli BL21(DE3)中的高效表达  53-56
  4.4 小结  56-58
第五章重组纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究  58-69
  5.1 导言  58
  5.2 材料与方法  58-61
    5.2.1 重组酶Cel 2和Cel 3的分离纯化  58-59
    5.2.2 SDS-PAGE  59-60
    5.2.3 纯酶Cel 2和Cel 3酶学性质测定  60
    5.2.4 纯酶Cel 2和Cel 3 Km值和V_(max)的测定  60-61
  5.3 结果与讨论  61-67
    5.3.1 重组酶Cel 2和Cel 3的分离纯化  61-63
    5.3.2 纯酶Cel 2和Cel 3的酶学性质  63-67
    5.3.3 纯酶Cel 2和Cel 3的K_m值和V_(max)的测定  67
  5.4 小结  67-69
附录1  69-70
附录2  70-74
参考文献  74-83
致谢  83-84
学位论文评阅及答辩情况表  84

碱性纤维素酶产生菌的筛选、酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达研究

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